雜交鵝掌楸總黃酮檢測及DPPH自由基清除作用

姚文紅 李飛陽 孫立梅 張林超

摘要：本研究通過AlCl3-NaAc顯色體系，采用分光光度法測定雜交鵝掌楸樹葉中總黃酮含量，并與其它部位含量及其DPPH自由基清除能力進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，該方法的最佳測定波長為272 nm，最佳測定時間范圍為顯色后30～80 min內(nèi)，精密度RSD=0.56%（n=5），回收率為103.64%（RSD=2.05%），該測定方法準(zhǔn)確可靠，利用該法測得雜交鵝掌楸樹葉總黃酮含量為4.67%（RSD=2.01%，n=5），明顯高于其它部位；不同部位提取的黃酮類化合物對DPPH自由基的清除能力由高到低為：樹根>樹葉>樹皮>花>葉柄>樹枝，IC50值依次為：6.65、9.88、10.25、15.55、19.71、24.15 μg/mL。雜交鵝掌楸樹葉中總黃酮含量較高，抗氧化性較強(qiáng)，具有開發(fā)利用的潛在價值。

關(guān)鍵詞：雜交鵝掌楸；總黃酮；含量檢測；DPPH自由基清除能力

中圖分類號：S792.210.8文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2016）09-0127-05

AbstractThe total flavonoids in Liriodendron hybrid leaves were determined by spectrophotometry using AlCl3-NaAc chromogenic system. Their contents and DPPH radical scavenging ability were compared with those in other parts. The results showed that the optimum wavelength was 272 nm for determination of total flavonoids in Liriodendron hybrid leaves. The optimal determination time was in 30～80 minutes after color development. The relative standard deviation （RSD） of precision test was 0.56% （n=5）， and the average recovery rate was 103.64% （RSD=2.05%）， so this method was accurity and reliable. Using this method， the contents of total flavonoids in Liriodendron hybrid leaves was 4.67% （RSD=2.01%， n=5）， which was obviously higher than those of any other parts. The ability of scavenging DPPH radical of total flavonoids from different parts was in the order of root>leaf>bark>flower>petiole>branches with the IC50 as 6.65， 9.88， 10.25， 15.55， 19.71 and 24.15 μg/mL respectively. In conclusion， the content of total flavonoids in Liriodendron hybrid leaves was significantly higher with stronger antioxidant activity， so it had potential value of development and utilization.

KeywordsLiriodendron hybrid； Total flavonoids； Content determination； DPPH radical scavenging ability

鵝掌楸Liriodendron chinense（Hemsl.）Sarg.為木蘭科鵝掌楸屬落葉大喬木[1]，是第四紀(jì)冰川期孑遺植物，主要分布于我國南方和美國東南部，分別被稱為鵝掌楸和北美鵝掌楸。20世紀(jì)70年代，我國著名育種學(xué)家葉培忠教授將兩者雜交，培育出雜交鵝掌楸。《全國中草藥匯編》中記載，鵝掌楸夏秋采樹皮，秋采根，曬干入藥，可治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、風(fēng)寒咳嗽等癥[2]，但是采剝樹皮和挖掘樹根，會影響鵝掌楸的正常生長，甚至導(dǎo)致其死亡。研究表明，鵝掌楸樹葉提取物對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和糞鏈球菌有明顯的抑菌效果[3]，提取鵝掌楸落葉中有效成分，發(fā)掘其潛在醫(yī)藥用途，對保護(hù)好來之不易的古樹名木綠化成果具有重要意義。

本試驗(yàn)首次對雜交鵝掌楸樹葉中總黃酮含量進(jìn)行了檢測，并與樹皮、樹根、樹枝、花等部位總黃酮含量進(jìn)行了比較，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對各部位所含黃酮類化合物的DPPH自由基清除能力進(jìn)行了比較，以期為雜交鵝掌楸藥用成分的開發(fā)提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

雜交鵝掌楸樹葉、樹皮、樹根、花、葉柄、樹枝，采集于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校區(qū)內(nèi)并由農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室鑒定；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；DPPH（WAKO公司）；其它試劑均為分析純；試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

UV-1601型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（龍口市先科儀器有限公司）；BHG-9070AS型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（金壇市榮華儀器制造有限公司）；AR1140型電子天平（上海奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）；SF-170型高速粉碎機(jī)（上海中藥機(jī)械廠）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1雜交鵝掌楸樹葉總黃酮提取參考文獻(xiàn)[4]方法，將洗凈晾干后的雜交鵝掌楸樹葉粉碎，過80目篩后用石油醚浸泡48 h，去除脂溶性色素，干燥后即制得樣品。準(zhǔn)確稱取樣品0.5000 g，按質(zhì)量體積比1∶35比例加入60%乙醇17.50 mL，85℃恒溫水浴回流提取60 min，冷卻至室溫后過濾，定容至100 mL，制得樣品液。

1.2.2雜交鵝掌楸樹葉總黃酮含量測定測定波長選擇：準(zhǔn)確稱取60℃恒溫干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品25.4 mg，加入60%乙醇適量，微熱溶解，冷卻后定容至250 mL，制得濃度為0.1016 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確移取樣品液、標(biāo)準(zhǔn)液2.00 mL，分別加入0.1 mol/L氯化鋁2.00 mL、1.0 mol/L乙酸鈉3.00 mL，60%乙醇定容至25 mL，充分混合后放置30 min，在200～500 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外可見吸收光譜掃描[5]，確定最佳測定波長。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00、5.50、6.00、7.00、8.00 mL，按照測定波長選擇中的方法，加入顯色劑，于272 nm測定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]，標(biāo)準(zhǔn)液濃度c對吸光度A線性回歸方程為A=0.005760+38.949c，R=0.9997，標(biāo)準(zhǔn)品在0～32.00 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：準(zhǔn)確移取樣品液1.00 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作中的方法，室溫下，每隔一段時間測定一次吸光度，連續(xù)記錄90 min，平行3次，尋找樣品液顯色絡(luò)合物吸光度最穩(wěn)定的時間范圍。

精密度試驗(yàn)：準(zhǔn)確移取樣品液1.00 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作中的方法，測定吸光度，平行5次，計(jì)算RSD。

加標(biāo)回收率試驗(yàn)：按照表2所示，準(zhǔn)確加入樣品液和標(biāo)準(zhǔn)液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作中的方法，測定吸光度，計(jì)算加標(biāo)回收率。

重復(fù)性試驗(yàn)：按照1.2.1中樣品液制備方法進(jìn)行操作，平行5次，得到5份提取液，分別準(zhǔn)確移取每份提取液1.00 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作中的方法，測定吸光度，平行3次，依據(jù)下式計(jì)算雜交鵝掌楸樹葉中總黃酮含量。

總黃酮含量（%） =[（A-0.05760）×25×100]/（38.949×1000×m）×100

式中：A為吸光度，m為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.3雜交鵝掌楸不同部位總黃酮含量測定按照1.2.1中方法提取雜交鵝掌楸的花、樹皮、樹根、葉柄、樹枝中黃酮類化合物，得到不同部位總黃酮提取液。準(zhǔn)確移取提取液1.00 mL，采用測定波長選擇中的方法，進(jìn)行顯色反應(yīng)，于250～500 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外可見光譜掃描；于272 nm測定每種提取液吸光度，平行3次，計(jì)算雜交鵝掌楸不同部位總黃酮含量[7]。

1.2.4DPPH自由基清除率的測定將雜交鵝掌楸不同部位提取液分別進(jìn)行旋蒸，得到濃縮液，加入適量蒸餾水，配成總黃酮濃度為50 μg/mL的待測液。準(zhǔn)確移取待測液0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00 mL于比色管中，60%乙醇補(bǔ)至5.00 mL，搖勻，分別加入0.2 mmoL/L的DPPH試劑5.00 mL，充分混合均勻，置于暗處反應(yīng)30 min后，于517 nm測定吸光度[8，9]，計(jì)算清除率。

DPPH自由基清除率（%）=[A對照-（A樣品-A空白）]/A對照×100

式中：A對照為60%乙醇與DPPH試劑混合液吸光度；A樣品為待測液與DPPH試劑混合液吸光度；A空白為待測液與60%乙醇混合液吸光度。

同上述操作，測定同濃度VC、BHT溶液對DPPH自由基清除作用，與雜交鵝掌楸不同部位待測液進(jìn)行比較。

2結(jié)果與分析

2.1雜交鵝掌楸樹葉總黃酮含量測定

2.1.1測定波長選擇由圖1可知，樣品液與標(biāo)準(zhǔn)液顯色掃描圖譜圖形走勢相似，均有三個明顯吸收峰。與標(biāo)準(zhǔn)液相比，樣品液在200～250 nm之間吸收峰發(fā)生紅移，350～500 nm之間最大吸收波長發(fā)生35 nm藍(lán)移，只有250～300 nm之間吸收峰與標(biāo)準(zhǔn)品一致，因此選擇最大吸收波長272 nm為測定波長，測定雜交鵝掌楸葉總黃酮含量。

紫外可見掃描圖譜

2.1.2穩(wěn)定性試驗(yàn)圖2顯示，開始階段，由于生成的顯色絡(luò)合物不夠穩(wěn)定，所測吸光度值偏小，30 min后，吸光度趨于穩(wěn)定，在30～80 min范圍內(nèi)，盡管示值有所變化，但在0.3606～0.3659之間波動（RSD=0.54%），變化很小，說明雜交鵝掌楸葉中黃酮類化合物的顯色絡(luò)合物十分穩(wěn)定，所測吸光度符合定量分析要求，因此顯色反應(yīng)30～80 min后為最佳測定時間。

2.1.3精密度試驗(yàn)由表1可知，采用該方法測定雜交鵝掌楸樹葉總黃酮含量，精密度RSD=0.56%<2.00%（n=5），該測定方法準(zhǔn)確可行。

雜交鵝掌楸不同部位總黃酮對DPPH自由基清除作用參考文獻(xiàn)[10，11]分析方法，總黃酮濃度相同條件下，雜交鵝掌楸不同部位提取的待測液與VC、BHT對DPPH自由基清除率的結(jié)果。

在總黃酮濃度0～25.00 μg/mL測定范圍內(nèi)，雜交鵝掌楸樹根部總黃酮對DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，總黃酮濃度（c）與清除率（y）呈現(xiàn)對數(shù)關(guān)系，樹葉和樹皮部位的總黃酮DPPH自由基清除能力基本一致，這三個部位提取的總黃酮清除能力均強(qiáng)于BHT，弱于VC；花、葉柄、樹枝提取的總黃酮DPPH自由基清除能力相對較弱。

雜交鵝掌楸不同部位提取的總黃酮，對DPPH自由基清除能力由高到低的順序?yàn)椋簶涓?樹葉>樹皮>花>葉柄>樹枝，半數(shù)清除率IC50值依次為：6.65、9.88、10.25、15.55、19.71、24.15 μg/mL（VC、BHT的IC50值分別為：5.47、12.37 μg/mL）。由此可見，雜交鵝掌楸樹葉中黃酮類化合物具備較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

3討論與結(jié)論

本研究通過AlCl3-NaAc顯色體系，采用分光光度法測定了雜交鵝掌楸不同部位的總黃酮含量，該測定方法操作簡單，穩(wěn)定性良好，回收率和精密度均達(dá)到測定要求。結(jié)果表明，雜交鵝掌楸樹葉、花、樹皮、樹根、葉柄、樹枝中總黃酮含量分別為：4.67%、3.11%、2.91%、1.72%、1.45%、1.18%，其中樹葉中總黃酮含量明顯高于其它部位。

雜交鵝掌楸不同部位提取液對DPPH自由基清除能力由高到低的順序?yàn)椋簶涓?樹葉>樹皮>花>葉柄>樹枝，半數(shù)清除率IC50值依次為：6.65、9.88、10.25、15.55、19.71、24.15 μg/mL（VC、BHT的IC50值分別為：5.47、12.37 μg/mL），雜交鵝掌楸樹葉中黃酮類化合物具備較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。