聚乙交酯丙交酯共聚物體外實時降解和加速降解的相關性研究

北京市醫療器械檢驗所（101111）林紅賽 劉曦 于少君 黃永富 岳衛華

聚乙交酯丙交酯共聚物（PLGA）是一種重要的可降解吸收的人工合成材料，由于其良好的生物相容性，已在組織工程、骨折內固定和外科手術縫合等領域廣泛應用[1][2]。體外降解試驗是評價這類材料的關鍵項目之一，體外降解試驗可以預估材料在體內降解的行為，在進行體內降解試驗之前先進行體外降解試驗可節約大量的試驗成本。

體外降解試驗一般可分為體外實時降解試驗和體外加速降解試驗[3]，體外實時降解試驗是模擬體內降解試驗的常用方法，但由于體外實時降解周期較長，不適合用于降解周期較長的樣品，尤其是當體外降解試驗用于評價樣品的均一性和穩定性時，大量開展體外實時降解試驗費時費力。因此，本研究旨在探討加速降解和實時降解的關聯性，選用醫療器械產品中常用的PLGA材料，同時進行體外實時降解和加速降解試驗，從抗張強度試驗、質量損失、特性黏度和降解產物測定四個方面進行實時降解和加速降解的測試，并分析實時降解和加速降解的試驗結果，建立數學模型，考察實時降解和加速降解可能存在的相關性。

附表 PLGA樣品實時降解和加速降解的抗張強度試驗結果

1 材料和方法

1.1 試劑與設備 PLGA樣品（PLGA釘子，其組成為丙交酯:乙交酯=60∶40，由國內某廠商提供）；乳酸標準品（Dr. Ehrenstorfer公司生產）；乙醇酸標準品（Dr. Ehrenstorfer公司生產）；六氟異丙醇（分析純）；磷酸二氫鉀（分析純）；二水合磷酸氫二鈉（分析純）；實驗用水為超純水。

電子天平（精度：0.0001g，梅特勒－托利多公司）；配紫外檢測器的高效液相色譜儀（Waters公司）；萬能材料試驗機（INSTRON公司）；真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 Sorensen緩沖液的配制[2]Sorensen緩沖液：由18.2%（體積分數）的1/15mol/L磷酸二氫鉀和81.8%（體積分數）的1/15mol/L磷酸氫二鈉混合而成，pH值約為7.50。1/15mol/L磷酸二氫鉀：稱取9.078g磷酸二氫鉀，加水溶解并定容至1L容量瓶中。1/15mol/L磷酸氫二鈉：稱取11.876g二水合磷酸氫二鈉，加水溶解并定容至1L容量瓶中。

1.3 溫度的選擇 參考標準GB/T 16886.13-2001[3]和YY/T 0473-2004[4]，實時降解試驗選用37℃±1℃的生理溫度，標準中建議加速降解選用高于37℃并低于材料的熔化或軟化的溫度范圍的某一個溫度下進行試驗。故本試驗通過差式掃描量熱儀測試PLGA樣品的玻璃化轉變溫度以進行溫度的選擇。

1.4 樣品的制備 參考行業標準YY/T 0473-2004進行降解試驗。PLGA樣品與Sorensen緩沖液浸提比例為500∶1（g∶mL），分別于37℃放置2天、3天、7天、14天、28天、35天、56天、63天和112天，50℃放置2天、4天、6天、8天、10天、14天、18天、21天、28天、35天和42天，到指定時間點后，分離樣品和降解液，每個時間點平行制備5份樣品。

1.5 抗張強度測試 取按1.4制備的樣品，取出降解后的樣品，用線將樣品的兩端固定，進行抗張強度測試，機頭加力速度：25mm/min，上下夾具之間的距離約為80mm。

1.6 質量損失的測定 降解前稱量樣品的質量W0，然后按1.4浸泡樣品，通過過濾分離樣品和降解液，用超純水清洗樣品5～6遍，于真空干燥箱中干燥至恒重得到降解后樣品質量Wt，質量損失百分比計算公式為：(W0-Wt)/W0×100%。

1.7 特性黏度的測定 取按1.4制備的樣品，通過過濾分離樣品和降解液，用超純水清洗樣品5～6遍，于真空干燥箱中干燥至恒重后，精密稱取50mg干燥后的樣品，用六氟異丙醇溶解并定容至50mL，3號垂熔漏斗過濾后，于25℃條件下，用烏氏黏度計測定。

1.8 降解產物測定 取分離后的降解液，用磷酸調節pH值至2.8，用流動相稀釋1～50倍后，0.45μm濾膜過濾，進樣分別測定降解產物中乙醇酸和乳酸的含量。色譜條件如下：Synergi Hydro-RP 80A C18色譜柱（250mm×4.6mm）；流動相為20mmol/LKH2PO4；流速0.6mL/min；柱溫30℃；紫外檢測器，檢測波長210nm；進樣量20μL。

2 結果

2.1 溫度的選擇 差式掃描量熱法測得PLGA樣品的玻璃化轉變溫度為52.8℃，故本試驗選擇了50℃±1℃作為加速降解的試驗溫度。

2.2 抗張強度試驗 PLGA樣品在37℃和50℃的抗張強度試驗結果見附表。50℃的樣品降解2天后輕微施加外力樣品即碎裂，所以50℃時樣品降解速率過快不易進行抗張強度試驗，故無法獲得抗張強度試驗結果。

2.3 質量損失 PLGA樣品在37℃和50℃下的質量損失百分比結果見附圖1，由附圖1可知，50℃的樣品降解速率明顯大于37℃的，經曲線擬合得到不同溫度下質量損失幾乎呈線性相關關系。37℃的曲線擬合方程：y=0.830x-5.321，R2=0.97，R2=0.98，50℃的曲線擬合方程：y=3.280x+5.222，R2=0.92。由曲線擬合的斜率可初步推斷，50℃的降解速率約是37℃降解速率的4倍。

2.4 特性黏度 測試PLGA樣品在37℃和50℃兩個不同溫度下的特性黏度。各個降解時間點的特性黏度值ηt比上降解前樣品的特性黏度η0，計算公式為：ηt/η0×100%，以ηt/η0%為橫坐標，時間天數為縱坐標，結果見附圖2，由附圖2可見，37℃和50℃的ηt/η0%與時間的關系圖均呈現對數相關關系。因此，取ηt/η0%的對數即ln(ηt/η0%)，以ln(ηt/η0%)為縱坐標，時間天數為橫坐標，繪制曲線圖，見附圖3，經曲線擬合得到不同溫度下ln(ηt/η0%)與時間幾乎呈線性相關關系。37℃條件下曲線方程為：ln(ηt/η0%)=-0.043x+4.568，R2=0.99；50℃條件下曲線方程為：ln(ηt/η0%)=-0.151x+4.392，R2=0.97。由擬合曲線斜率可初步推斷，50℃的降解速率是37℃降解速率的3.5倍。

2.5 降解產物的測定結果 乙醇酸和乳酸的方法驗證結果：降解液中乙醇酸的線性范圍為2.500μg/mL～250.0μg/mL（r=0.9999），定量限為0.48μg/mL，加標回收率為99.4%～102.6%，乙醇酸峰面積的RSD為0.5%（n=6）；降解液中乳酸的線性范圍為2.642μg/mL～264.2μg/mL（r=0.9999），定量限為1.0μg/mL，加標回收率為97.9%～103.2%，乳酸峰面積的RSD為0.1%（n=6）。

附圖1 PLGA樣品實時降解和加速降解的質量損失百分比比較

附圖2 PLGA樣品實時降解和加速降解的ηt/η0%比較

附圖3 PLGA樣品實時降解和加速降解的ln(ηt/η0%)比較

附圖4 PLGA樣品實時降解和加速降解的乙醇酸含量比較

附圖5 PLGA樣品實時降解和加速降解的乳酸含量比較

將不同時間點的樣品稀釋1～50倍后進樣測得的濃度值與浸提液的體積相乘，折算成降解液中乙醇酸和乳酸的絕對含量。由附圖4和附圖5可知，50℃的試驗條件下，在降解第10天到21天之間，乙醇酸和乳酸的含量顯著增加，降解約28天后，乙醇酸和乳酸的含量幾乎趨于穩定；37℃的試驗條件下，在降解第28天到63天之間，乙醇酸和乳酸的含量顯著增加，降解約63天以后，乙醇酸和乳酸的含量幾乎趨于穩定。

3 討論

據文獻報道[5-8]，PLGA材料的降解為均相降解，降解過程主要分為三個過程，分別是PLGA的吸水、酯鍵的水解斷裂和可溶性低聚物的擴散溶解。體外加速降解和實時降解都經歷這三個過程，當樣品接觸緩沖溶液時，首先發生吸水溶脹現象，然后逐步發生酯鍵的水解斷裂，該階段大約發生在實時降解過程的7天后（加速降解約在2天后），此時樣品由高聚物斷裂成中度聚合物，故樣品的特性黏度明顯減小，但樣品外觀形態和質量損失并沒有明顯的改變。當實時降解約28天后（加速降解約在2天后），樣品質量損失開始明顯增加，當實時降解約28天后（加速降解約在10天后），降解液中降解產物乙醇酸和乳酸的含量開始明顯增加。加速降解試驗三個階段可能不是很明顯，尤其是溶脹和酯鍵水解發生的很快，但通過質量損失百分比和特性黏度百分比的對數的曲線擬合斜率可知，加速降解速率約是實時降解速率的3.5～4倍。因此，選用加速降解試驗替代實時降解試驗具有一定的可能性，并縮短將近四分之三的試驗時間，尤其適用于降解周期較長的PLGA樣品的降解試驗的開展。但是，PLGA材料的降解受多種因素的影響，如分子量、結構組成和工藝等，因此不同來源的PLGA材料的加速降解和實時降解的倍比關系可能不同。

4 結論

本試驗結果表明，PLGA樣品（丙交酯∶乙交酯=60∶40）的加速降解和實時降解存在一定的相關性，本試驗條件下發現，PLGA的加速降解速率約是實時降解速率的3.5～4倍。