蘋果液泡膜葡萄糖轉運蛋白基因MdVGT1的克隆與表達分析

許海峰，劉靜軒，王意程，左衛芳，曲常志，王得云，張 靜，姜生輝，王 楠，陳學森

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蘋果液泡膜葡萄糖轉運蛋白基因的克隆與表達分析

許海峰，劉靜軒，王意程，左衛芳，曲常志，王得云，張 靜，姜生輝，王 楠，陳學森

（山東農業大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室，山東泰安 271018）

【目的】研究新疆紅肉蘋果雜種一代優系‘紅脆1號’液泡膜葡萄糖轉運蛋白基因生物學信息、表達水平及其在糖代謝中的功能，旨在為進一步完善功能型蘋果育種的理論與技術體系提供參考。【方法】以新疆紅肉蘋果雜種一代優系‘紅脆1號’為試材，克隆，對其進行生物信息學分析；并采用熒光定量PCR分析該基因在不同組織及不同發育時期的表達，分析‘嘎啦’組培苗中該基因在葡萄糖誘導下的表達，通過酵母雙雜交驗證其互作關系，并通過原核誘導獲得重組蛋白。【結果】在‘紅脆1號’中克隆獲得全長，測序發現其包含1 506 bp完整的開放閱讀框，編碼501個氨基酸，預測其編碼蛋白質分子量為53.16 kD，等電點為5.92，定位于蘋果基因組的1號染色體上，由14個外顯子和13個內含子構成；糖代謝相關基因系統進化樹分析表明，與、、在同一個進化枝上，功能域分析表明，MdVGT1蛋白含有12個跨膜區域；在蘋果的花、葉和幼果中均有較高的表達，在果實發育中，其表達量與葡萄糖含量有顯著的相關性；啟動子含有與抗逆、糖信號及激素信號相關的順式作用元件；葡萄糖處理‘嘎啦’組培苗一周后，的表達量明顯提高；酵母雙雜交試驗表明，MdVGT1與MdTMT1在體外能相互作用，并通過原核誘導獲得了MdVGT1的重組蛋白。【結論】在‘紅脆1號’蘋果中克隆獲得了液泡膜葡萄糖轉運蛋白基因，其可能與MdTMT1互作共同轉運葡萄糖進入液泡膜。

蘋果；液泡膜葡萄糖轉運蛋白；；基因克隆；酵母雙雜交；原核表達

0 引言

【研究意義】新疆野蘋果及其紅肉變型（f.（Dieck）Langenf.）是世界栽培蘋果的祖先種，遺傳多樣性極為豐富，是蘋果品質育種的重要種質[1]，但新疆野蘋果資源正遭到嚴重破壞，瀕臨滅絕，挖掘利用不夠；生產上的栽培品種單一化態勢明顯，遺傳基礎變窄，而市場和消費者需要特色、多樣化品種[2]。因此，進一步以新疆野蘋果及其紅肉變型為親本創建的雜種分離群體為材料，研究MdVGT1蛋白在果實糖代謝中的作用，完善果實糖品質性狀遺傳與發育機理，對新疆野蘋果資源的科學保護與持續高效利用具有重要意義。【前人研究進展】植物糖的運輸主要由糖轉運蛋白介導，目前在擬南芥中鑒定的至少有69種糖轉運蛋白，分屬8個亞家族，其中包括單糖轉運蛋白家族[3]。多種糖的運輸由單糖轉運蛋白介導，如果糖、葡萄糖、麥芽糖及各種糖醇等，已報道的所有單糖轉運蛋白都屬于協助擴散超家族（MFS），也稱為共轉運蛋白家族。根據其運輸方式或運輸物質不同，包括液泡膜葡萄糖轉運蛋白、液泡膜單糖轉運蛋白和己糖轉運蛋白等[4]，第一個被鑒定的單糖轉運蛋白是綠藻CkHUP1，其對葡萄糖有一定的特異性[5]。果實中的糖雖依靠葉片光合作用產物的輸入，但其糖分積累主要還是果實內部的作用[6]，積累場所主要在液泡中，且受液泡膜上糖轉運蛋白的嚴格調控[7-8]。目前在擬南芥中己經鑒定的液泡膜糖轉運蛋白主要有液泡膜葡萄糖轉運蛋白（VGT）[9-10]和液泡單糖轉運蛋白（TMT）[8]，它們都定位于液泡膜。在蘋果中，基因家族也得到鑒定，其中，和可能參與了果實成熟期蔗糖和果糖的積累[11]。【本研究切入點】課題組圍繞新疆野蘋果資源的保護與利用，在群體遺傳結構等相關研究的基礎上，于2006年率先構建了新疆紅肉蘋果與栽培蘋果品種的雜種分離群體[12-13]。陳學森等[14]探討了雜種一代類黃酮含量等性狀遺傳變異特點，并提出“功能型蘋果”概念。張芮[15]和許海峰[16]等進行了雜種一代不同株系果實質地和類黃酮含量比較及相關基因表達分析，但雜種一代株系糖代謝機理及液泡膜葡萄糖轉運蛋白VGTs有待進一步深入研究。【擬解決的關鍵問題】本研究以新疆紅肉蘋果雜種一代優系‘紅脆1號’不同發育時期的果實及‘嘎啦’組培苗為試材，對蘋果液泡膜葡萄糖轉運蛋白MdVGT1進行生物信息及表達水平的分析，并通過酵母雙雜交驗證其互作關系及原核誘導獲得重組蛋白，旨在為進一步研究蘋果液泡膜葡萄糖轉運蛋白的功能奠定基礎，并為完善功能型蘋果育種的理論與技術體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

植物材料為從新疆紅肉蘋果（f.）中的‘塔爾阿爾瑪’與‘煙富3號’（cv. Fuji）雜種一代選育出的‘紅脆1號’優株以及‘嘎啦’組培苗（MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IAA）。從2015年4月開始，分別采集‘紅脆1號’花后30、60、90及120 d等不同發育時期的果實，取樣后液氮速凍，-80℃保存備用；另取‘紅脆1號’初花時的花及花后30 d的幼果、新生葉、生長根、幼莖，液氮速凍，-80℃保存備用；用葡萄糖（0、10和20 g·L-1）處理‘嘎啦’組培苗一周后，將苗液氮速凍，-80℃保存備用。

1.2 總RNA的提取與熒光定量

植物RNA提取試劑盒（DP432）、反轉錄試劑盒（KR106）、SYBR染料（FP205）均購自北京天根公司。熒光定量PCR儀型號為伯樂CFX96，按照SYBR? Green PCR Master Mix 說明書配制熒光定量PCR反應體系，每個樣品設3個重復。反應體系為20 μL：10 μL 2.5×Real Master Mix/20×SYBR Solution，1 μL cDNA（50 ng·μL-1），上下游引物各1 μL（5 μmol·L-1），7 μL ddH2O。反應條件：①95.0℃預變性30 s；②95.0℃變性5 s；③58℃退火10 s；④72.0℃延伸30 s（②—④共45個循環）；⑤ 65℃孵育20 s；⑥溶解溫度從55℃到 95℃每升高0.5℃保持1 s；⑦停止反應。以蘋果為內參，每個基因擴增均伴有內參同時擴增，默認條件下讀取Ct值，采用2-ΔΔCT方法進行數據分析[17]。

1.3的克隆，生物信息分析與進化樹的構建

利用擬南芥AtVGT1蛋白序列在蘋果基因組中Blast比對得到一個基因序列號為MDP0000863082的基因，暫命名為，設計一對引物5′-ATG GCGTCGGATCCTGAG-3′和5′-CTAAAGGCACTT GGCCTCAAT-3′，以‘紅脆1號’cDNA為模板，按照phusion高保真DNA擴增酶（F530）說明書進行PCR，用1%的瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳并回收目的條帶，連接PLB零背景載體（VT205）進行測序。

利用Expasy網站（http://web.expasy.org/protparam/）對氨基酸的理化性質進行分析，利用SMART網站（http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?GENOMIC=1）對蛋白結構功能域進行分析，利用MEGA 5軟件構建進化樹。

1.4 果肉葡萄糖含量的測定

參照趙智中等[18]的方法略做改進，準確稱取5 g果肉，研磨成勻漿后轉入到30 mL離心管中，加入25 mL超純水，80℃水浴超聲提取1 h，使可溶性糖和有機酸充分浸出，冷卻后10 000 r/min離心15 min，將上清液過濾到50 mL的容量瓶中，殘渣加入15 mL超純水再提取，合并上清液，超純水定容。用0.22 μm濾膜過濾后，液相色譜根據葡萄糖標準曲線和樣品峰面積計算葡萄糖含量。色譜條件：島津RID-10A示差折光檢測器，色譜柱YMC Polyamine II（長度×內徑：250 mm×4.6 mm，顆粒徑：5 μm），流動相：乙腈﹕水=75﹕25（V﹕V），靈敏度：4，進樣量：10 μL，流速：0.8 mL·min-1，柱溫：30℃。

1.5 酵母雙雜交

用引物5′-CATATGATGGCGTCGGATCCTGAG- 3′和5′-GAATTCCTAAAGGCACTTGGCCTCAAT-3′擴增的編碼框序列，用引物5′-CATATGAT GAAGAAGGGAGCCGTG-3′和5′-GTCGACTTACTCGTTTTTGGCAGCC-3′擴增的編碼框序列，之后連接PLB零背景載體。用Ⅰ和RⅠ對MdVGT1-PLB和pGADT7分別進行雙酶切，用Ⅰ和Ⅰ對MdTMT1-PLB和pGBKT7分別進行雙酶切，構建pGADT7-和pGBKT7-重組載體。按照YeastmakerTMYeast Transformation System 2試劑盒（Clontech）說明書方法，將這兩種重組質粒共轉化到酵母Y2H感受態細胞，細胞先培養在-T-L選擇性培養基中（-Leu/Trp，Clontech），然后將生長的細胞培養在-T-L-H-A選擇性培養基中（-Ade/-His/-Leu/-Trp，Clontech），最后用X-α-gal作為底物添加到四缺培養基中檢測β-galactosidase。

1.6原核表達

用引物5′-GAATTCATGGCGTCGGATCCTGAG- 3′和5′-GTCGACCTAAAGGCACTTGGCCTCAAT-3′擴增的編碼框序列，之后連接到PLB零背景載體。用RⅠ和Ⅰ對克隆載體和原核表達載體pET28a分別進行雙酶切，構建原核重組表達載體pET28a-，將重組質粒轉化到大腸桿菌DE3感受態中。加入1 mmol·L-1IPTG后分別在0、2、4、6 h時取樣于4℃暫時保存，取6 h菌液離心收集菌體，用8 mL PBS緩沖液懸浮，超聲破碎（打6 s，停9 s，25個循環）分離可溶性蛋白和包涵體，SDS-PAGE電泳檢測。

1.7 數據分析

用Excel 2007進行作圖和數據分析，DPS 7.05軟件進行顯著性分析，spss進行相關性分析。

2 結果

2.1的克隆與基因組結構分析

如圖1所示，獲得了一條大小約為1 500 bp的條帶，與預期大小一致，序列測定與分析表明，的完整開放閱讀框長度為1 506 bp，編碼501個氨基酸，預測其蛋白質分子量為53.16 kD，等電點為5.92。

圖1 MdVGT1編碼區全長的RT-PCR擴增

利用GDR數據庫（http：//www.rosaceae.org/）分析的染色體位置和基因結構。如圖2所示，位于蘋果基因組的1號染色體上，由14個外顯子和13個內含子構成。

2.2 MdVGT1的進化樹和結構功能域

如圖3所示，液泡單糖轉運蛋白TMT和蔗糖轉運蛋白SUT/SUC分別在不同物種間都在同一個進化樹枝上，因其具有相同的功能。而MdVGT1和擬南芥AtVGT1同樣在同一個進化樹枝上，推測蘋果與擬南芥的功能相似（圖3中比例尺0.1代表每10個氨基酸有1個不同）。SMART功能域分析表明MdVGT1有12個跨膜區域。

圖2 MdVGT1染色體定位和基因組結構

圖3 糖代謝相關轉運蛋白系統進化樹分析

2.3組織表達特性及果實發育過程中表達量與葡萄糖含量相關性

由圖4可得，在根、莖、葉、花、果實中都有表達，其中在葉、花和果實中具有較高的表達。由圖5可得，表達量和葡萄糖含量均在花后120 d達到最大值，經Spss顯著性分析可得，表達量和葡萄糖含量在0.05水平上顯著相關（顯著性系數為0.986）。

2.4啟動子順式作用元件和葡萄糖處理‘嘎啦’組培苗的表達

利用https://sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi?sid=&lang=en&pj=640&action=page&page=newplace網址分析啟動子的順式作用元件，結果如表1。啟動子序列含有多個與抗逆性相關的作用元件：ACGTATERD1和MYBCORE是與脫水相關的元件[19-21]，MYB1LEPR是與防御相關的元件[22]，MYCCONSENSUSAT是與低溫相關的元件[23-24]；SREATMSD是與糖信號相關的元件[25]。此外，在啟動子序列中還發現了不同激素響應元件：細胞分裂素誘導順式作用元件CPBCSPOR[26]，脫落酸相關作用元件ABRELATERD1[27]，乙烯代謝相關作用元件ERELEE4[28-29]。表明除受糖信號誘導外，還可能參與了抗逆和逆境脅迫反應。

圖4 MdVGT1在不同蘋果組織中的相對表達量

圖5 ‘紅脆1號’蘋果果實不同發育期VGT1相對表達量和葡萄糖含量

圖6中，CK表示‘嘎啦’組培苗生長在不添加葡萄糖的培養基，處理1表示‘嘎啦’組培苗生長在10 g·L-1培養基（MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IAA+ 10 g·L-1葡萄糖），處理3表示‘嘎啦’組培苗生長在20 g·L-1培養基（MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IAA+ 20 g·L-1葡萄糖）。由圖6可得，培養基中葡萄糖含量越高，的表達量也越高。

圖6 MdVGT1基因在葡萄糖誘導下的相對表達量

表1 MdVGT1基因上游調控序列重要順式作用元件分析

2.5 MdVGT1與MdTMT1酵母雙雜交

由圖7酵母雙雜交試驗可得，空載體pGADT7和MdTMT1+pGBKT7、空載pGBKT7和MdVGT1+pGADT7共轉Y2H均在二缺板上生長，在四缺及四缺+X-α-gal不生長；而MdVGT1和MdTMT1共轉Y2H在二缺、四缺及四缺+X-α-gal都能生長，因此推測其在體外能夠相互作用。

2.6 MdVGT1蛋白的原核表達

由圖8可得，1 mmol·L-1IPTG誘導0、2、4、6 h后的蛋白提取物經SDS-PAGE電泳在55 kD左右有一條帶，與預期蛋白大小一致，且顏色隨時間推移變深。此外，經超聲破碎后，誘導產生的MdVGT1蛋白以包涵體的形式存在。

圖7 MdVGT1和MdTMT1酵母雙雜交

圖8 pET28a-VGT1在大腸桿菌BL21中的表達產物、上清液和包涵體蛋白的SDS-PAGE

3 討論

3.1 液泡膜葡萄糖轉運蛋白MdVGT1與糖代謝關系

植物中糖轉運蛋白都有相似的拓撲結構，為膜結合蛋白，有12個跨膜結構域，不僅可以跨細胞膜，有的還跨液泡膜和質體膜或者線粒體膜[30]。擬南芥和主要在花和葉中表達[8-9]，其中對葡萄糖有著高度特異性，而不僅能轉運葡萄糖，對果糖也有一定的選擇性，同時也可作為蔗糖的逆向轉運蛋白，轉運蔗糖進入液泡[10,31]。另有研究表明擬南芥和蘋果能夠參與ABA誘導的糖代謝途徑[32-33]，而可受低溫，鹽脅迫等誘導參與逆境脅迫與糖信號代謝[8]。本研究發現，MdVGT1蛋白的結構和功能與擬南芥糖轉運蛋白類似，分析其啟動子發現，它可能參與激素和逆境脅迫相關的糖代謝途徑，其表達水平對葡萄糖含量有一定的特異性，且可能與MdTMT1在液泡膜形成復合體共同轉運葡萄糖進入液泡。同時通過原核誘導獲得了MdVGT1的重組蛋白，上述工作為進一步研究MdVGT1蛋白的功能奠定了基礎。

3.2 糖代謝與功能型蘋果育種

有效利用現代分子生物學技術，及時借鑒模式植物的最新研究進展與成果，積極探討果樹特色種質或新品種在品質性狀形成與調控機理方面的特異性，是近幾年果樹分子生物學研究領域的重要趨勢之一[15]。因此，新疆野蘋果資源的親本利用，不僅可培育功能型蘋果等特色多樣化品種（系），實現資源的利用保存，創建多層次的種質資源保護保存技術體系，同時為果實糖品質性狀遺傳與發育機理的研究提供了豐富的試驗材料[2]。本文以新疆紅肉蘋果雜種一代‘紅脆1號’為試材，克隆了液泡膜葡萄糖轉運蛋白MdVGT1，初步探討了其與葡萄糖及MdTMT1的關系，未來將對新疆紅肉蘋果雜種分離群體糖含量差異的優株進行糖代謝相關基因的表達分析及糖轉運蛋白的研究，旨在從新疆紅肉蘋果雜種一代中選育出含糖量多的功能型蘋果品種。

4 結論

在‘紅脆1號’蘋果中克隆獲得了液泡膜葡萄糖轉運蛋白基因，其表達量與葡萄糖含量顯著相關且受葡萄糖誘導；其可能與MdTMT1互作共同轉運葡萄糖進入液泡膜。原核誘導獲得了其重組蛋白，可用于進一步研究MdVGT1蛋白在果實糖代謝中的轉運機制。

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（責任編輯 趙伶俐）

Isolation and Expression Analysis of a Vacuolar Glucose Transporter Gene

XU Hai-feng, LIU Jing-xuan, WANG Yi-cheng, ZUO Wei-fang, QU Chang-zhi, WANG De-yun, ZHANG Jing, JIANG Sheng-hui, WANG Nan, CHEN Xue-sen

(College of horticulture science and engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology, Tai’an 271018, Shandong)

【Objective】In order to develop the theory and breeding technology of functional apple, the bioinformatics, the expression level and the function in the sugar metabolism several aspects of vacuolar glucose transporter genef.F1population were studied. 【Method】Thethe bioinformation of it was analyzed. The expression level ofexpression ofinduced by glucose in tissue culture seedlings of ‘gala’ was also analyzed. Meanwhile, the interaction betweenandwas verifiedby yeast two-hybrid system and the recombinant protein by the prokaryotic induction technology was obtained. 【Result】 The full length of，and pI was 5.92. Furthermore, it was inferred that the gene includes 14 exons and 13 introns, and is located on the chromosome 1 of the apple genome. A phylogenetic tree indicated that,,andare located in the same evolutionary branch. Analysis of functional domain showed that MdVGT1 contains 12 transmembrane regions.has the higher expression level in flowers, leaves and young fruits of apples, and its expression has a significant correlation with the content of glucose during the development stage of fruits. The promoter ofcontains several typical cis-acting elements, including defense responsive elements, sugar signaling responsive elements and phytohormone responsive elements, and the expression of MdVGT1 in tissue culture seedlings of ‘gala’ was significantly increased after glucose treatment a week later. The yeast two hybrid experiments showed that the MdVGT1 could interact with MdTMT1 . In addition, the recombinant protein of MdVGT1was obtained by the prokaryotic induction technology. 【Conclusion】The vacuolar glucose transporter gene

apple; vacuolar glucose transporter;; gene clone; yeast two hybrid; prokaryotic expression

2016-04-26；接受日期：2016-07-14

國家自然科學基金（31572091）、國家公益性行業（農業）科研專項（201303093）

許海峰，E-mail：997524744@qq.com。通信作者陳學森，E-mail：chenxs@sdau.edu.cn