小菜蛾堿性磷酸酯酶受體表達與分子模擬

張 霄，胡曉丹，仲建鋒，武愛華，徐重新，劉 媛，張存政，謝雅晶，劉賢金

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小菜蛾堿性磷酸酯酶受體表達與分子模擬

張 霄，胡曉丹，仲建鋒，武愛華，徐重新，劉 媛，張存政，謝雅晶，劉賢金

（江蘇省農業科學院食品質量安全與檢測研究所/江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地/農業部農產品質量安全 控制技術與標準重點實驗室，南京 210014）

【目的】利用原核表達小菜蛾()中腸膜結合堿性磷酸酯酶（membrane-bound alkaline phosphatase, mALP）并經Ligand blot驗證其具有與Cry1Ac毒素結合的能力；通過同源建模和分子對接研究Cry1Ac-mALP的結合模式，預測毒素和受體結合區域及關鍵氨基酸位點（熱點殘基），為了解毒素-受體互作機制及分子改造增強Cry毒素活性的研究打下基礎?！痉椒ā酷槍π〔硕阭ALP全長設計引物，并以小菜蛾cDNA為模板擴增mALP基因，雙酶切后用T4連接酶連接至pET-26b原核表達載體，將構建的pET-26b-mALP載體轉化Trans1-T1克隆感受態，挑取克隆并提取質粒后進行PCR、雙酶切和測序驗證，將驗證無誤的重組質粒轉化BL21（DE3）表達感受態細胞，進行誘導表達。將誘導表達后的mALP轉至PVDF膜上，通過Western blot和Ligand blot分別驗證mALP是否成功表達以及是否具有與Cry1Ac毒素結合的能力。對mALP進行同源建模、分子動力學模擬以及模型評價，獲得的mALP最佳三維結構與Cry1Ac毒素利用PatchDOCK和FireDock程序進行分子對接試驗，對確定的最佳毒素-受體復合物進行結合區域和結合氨基酸位點分析，并通過計算機輔助的丙氨酸突變掃描試驗確定毒素和受體參與的關鍵氨基酸殘基。【結果】 擴增出小菜蛾mALP基因并克隆至pET-26b原核表達載體，轉化BL21（DE3）表達感受態后挑取陽性克隆提取質粒后進行PCR、雙酶切和測序均顯示構建正確。通過原核表達和Western blot驗證成功表達了mALP蛋白，并經Ligand blot試驗證實了原核表達的mALP具有和Cry1Ac毒素結合的能力。利用同源建模成功獲得了mALP的三維結構，通過PatchDOCK和FireDock分子對接程序，獲得毒素和受體的對接復合物，通過溶劑可及表面積變化計算和Ligplot分析，確定毒素結構域II和結構域III均參與了受體結合，并且毒素和受體均以疏水結合和氫鍵結合模式參與結合，最后通過熱點殘基預測發現Cry1Ac毒素和mALP中分別有3個氨基酸殘基（376Asn、443Ser和486Ser）和4個氨基酸殘基（452Arg、499Thr、502Tyr和513Tyr）是參與互作的關鍵氨基酸位點。【結論】經原核表達的小菜蛾mALP同樣具有與Cry1Ac毒素結合的能力，并利用分子模擬技術預測了小菜蛾mALP三維結構及與Cry1Ac毒素結合模式。

堿性磷酸酯酶；原核表達；配體印跡；同源建模; 分子對接；熱點殘基預測

0 引言

【研究意義】蘇云金芽孢桿菌（，Bt）可在其生命周期中產生一種專一性極強的晶體毒素（crystal toxin，Cry toxin），導致昆蟲腸道細胞溶解或引發細胞凋亡程序，從而殺死昆蟲[1-3]。Cry1Ac毒素作為應用最為廣泛的一類微生物殺蟲蛋白，在防治大量田間害蟲中已取得巨大成效[4-5]。然而，Cry毒素的抗藥性問題已成為世界級難題，尤其是小菜蛾（）被認為是田間抗藥性最嚴重和最難防治的世界性害蟲之一[6-8]。目前認為受體的變異或缺失導致毒素結合能力的改變是抗性產生的最主要原因[9-11]。因此研究毒素-受體結合模式對改善抗性問題顯得尤為重要，分子模擬正是針對這一問題而提出的理性解決方法[12-13]。【前人研究進展】堿性磷酸酯酶（alkaline phosphatase，ALP）作為Cry毒素在害蟲體內的靶標受體之一[1-3]，已有很多研究顯示ALP受體與害蟲抗性密切相關。Jurat-Fuentes等[14]比較分析了敏感性和抗性煙芽夜蛾（）幼蟲中ALP與Cry1Ac的結合特征，推測ALP為使其產生抗性的重要因素；Jurat-Fuentes等[15]利用逆轉錄定量PCR（qRT-PCR）發現多種鱗翅目靶標昆蟲中腸膜結合堿性磷酸酯酶（membrane- bound alkaline phosphatase，mALP）的表達量下調是導致其產生抗性的重要因素；Chen等[16]報道了敏感性和抗性棉鈴蟲ALP受體上影響與Cry毒素結合區域（toxin-binding region，TBR），首次發現棉鈴蟲ALP受體TBR區域對Cry毒素活性發揮的作用。小菜蛾是田間最早報道對Cry1Ac毒素產生抗性的昆蟲，因而其抗性問題也一直是本領域的研究熱點[17-19]。Yang等[20]分別對敏感性和抗性小菜蛾的堿性磷酸酯酶以及其他潛在受體分別進行表達和生物學研究，為小菜蛾抗性治理提供了指導；劉潔等[21]克隆小菜蛾抗性、敏感種群中的部分堿性磷酸酶基因，通過與敏感種群相比發現抗性種群中該基因片段發生基因突變，該結果對于進一步研究小菜蛾全基因結構、功能有重要意義；近期Guo等[22]報道并證實了小菜蛾mALP可被MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）信號途徑反式調控從而導致小菜蛾對Cry毒素的高抗性。在眾多研究毒素-受體結合模式的方法中，利用分子模擬（同源建模和分子對接）研究，在已知毒素和受體可以發生結合的情況下，正確預測復合物的結合模式是一種極為有效的途徑[23-24]，Shan等[25]利用同源建模構建了棉鈴蟲的ALP三維模型并通過生物信息學在線網站對ALP受體功能進行了理論研究?！颈狙芯壳腥朦c】利用分子模擬研究Cry1Ac和小菜蛾mALP的結合模式還未見報道。【擬解決的關鍵問題】原核表達具有Cry1Ac毒素結合活性的mALP受體，用于體外進行與毒素模擬物的結合分析，并利用分子模擬研究毒素和受體互作模式以及參與互作的關鍵氨基酸位點，進一步了解Cry毒素與mALP的互作機制，為利用分子改造提升Cry毒素與受體結合能力以增強Cry毒素活性的研究提供新的研究思路和技術途徑。

1 材料與方法

試驗于2015年12月至2016年7月在江蘇省農業科學院食品質量安全與檢測研究所完成。

1.1 材料

1.1.1 供試昆蟲、表達載體及菌株 小菜蛾（ 4齡幼蟲）由筆者實驗室于室內飼養多年，期間未施任何殺蟲劑；表達載體pET-26b（+）購于Novagen公司；Trans1-T1、BL21（DE3）感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 試驗試劑 Trizol和Super script III反轉錄試劑盒購自Invitrogen公司；Fast Pfu DNA聚合酶購自近岸蛋白質科技有限公司；卡那霉素和IPTG購自Sigma公司；PCR純化試劑盒購自Promega公司；膠回收試劑和質粒提取試劑盒購自Axygen公司；I、I內切酶、T4 DNA連接酶購自美國NEB公司；HRP標記Anti His-Tag鼠單抗、HRP-羊抗兔IgG購自GE Healthcare公司；蛋白Marker購自Thermo公司；增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PVDF膜購自BIOSHRP；其他試劑均為分析純級試劑。

1.2 方法

1.2.1 小菜蛾mALP基因擴增 將小菜蛾4齡幼蟲置冰上冷凍，從其尾部拉取中腸，用0.5%的生理鹽水清洗干凈，放入勻漿器中，利用Trizol法提取總RNA，用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA第一鏈（按說明書方法）。根據Genbank公布的小菜蛾mALP基因序列（登錄號：GenBank KC841472.2）設計全長引物。上游引物mALP-F：5′-CATGCCTCTC GCGTGGCGCGCCAGGTATC-3′（下劃線為I酶切位點，CATG：保護堿基，CC：防止移碼所加堿基）；下游引物mALP-R：5′-AATTAATAAGC GTCTCAGATACG-3′（下劃線為I酶切位點，AAT：保護堿基）。PCR擴增條件：95℃預變性2 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環；最后72℃終延伸10 min，4℃保存。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，PCR產物純化試劑盒純化目的片段。

1.2.2 重組質粒pET-26b-mALP的構建及鑒定 純化后的mALP基因片段和提取的pET-26b表達載體，同時進行Ⅰ和Ⅰ限制性內切酶酶切，純化回收酶切產物，經T4連接酶連接過夜，次日轉化至Trans1- T1感受態細胞并涂布于含50 μg·mL-1卡那霉素的LB平板上進行陽性轉化子篩選，挑取陽性克隆過夜培養后提取質粒進行PCR鑒定、雙酶切鑒定及序列測定（由上海生工生物工程公司完成），并將測序結果提交至GenBank進行序列同源性比對。

1.2.3 pET-26b-mALP在BL21（DE3）中的誘導表達和Ligand blot試驗鑒定將pET-26b-mALP重組質粒轉化至BL21（DE3）。挑取陽性克隆，經測序及雙酶切驗證后接種于含50 μg·mL-1卡那霉素的LB培養基中過夜培養，以pET-26b空載作為對照。次日按1%比例轉接于含0.5%葡萄糖和50 μg·mL-1卡那霉素的LB培養基中，37℃，250 r/min振蕩培養至OD600約為0.6—0.8，加入終濃度為0.5 mmol·L-1IPTG，25℃誘導表達16 h，過夜誘導表達產物與變性上樣緩沖液混勻煮沸后經SDS-PAGE電泳分離后，用濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，5% MPBS（含5%脫脂奶粉的PBS）室溫封閉過夜，用PBST（含0.5%吐溫-20的PBS）洗膜3次每次10 min，加入HRP標記的Anti His-Tag鼠單抗（1﹕3 000）作為二抗，室溫孵育2 h后洗膜，用增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色，檢測目的蛋白的表達。Ligand blot前期步驟均與Western blot一致，并增加pET26b空載誘導產物對照和mALP轉膜后不與Cry毒素孵育對照，排除非特異性和假陽性。過夜封閉洗膜后，加入Cry1Ac毒素孵育2 h后洗膜，加入親和純化后的兔抗Cry1Ac多抗（筆者實驗室自己制備）孵育2 h后洗膜，加入HRP-羊抗兔IgG（1﹕3 000）孵育2 h后洗膜，增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色，檢測目的蛋白是否具有與Cry1Ac毒素結合能力。

1.2.4 小菜蛾mALP同源建模及模型評價 將本研究獲得的mALP基因翻譯后的氨基酸序列作為目標蛋白，用BLAST中的blastp suite對PDB蛋白結構數據庫（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分別進行多序列同源性搜索，取同源性最高的晶體結構（PDB ID：1K7H）作為同源建模模板，同步將蛋白序列提交至I-TASSER進行建模。Cry1Ac在PDB數據庫中已有晶體結構（PDB ID：4ARY），可直接下載其pdb文件。利用Swiss-Model（http://swissmodel. expasy.org/）和I-TASSER（http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I- TASSER/），分別預測mALP的三維結構。將模型能量最小化后，采用OpenMM Zephyr程序對其進行分子動力學模擬。最終將獲得的模型結構采用生物信息學在線網站http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/中的PROCHECK、ERRAT以及Verify3D模塊進行評估，檢測其合理性，比較分析后選取最佳mALP三維模型進行后續研究。

1.2.5 小菜蛾mALP與Cry1Ac分子對接 將Cry1Ac和mALP的pdb文件利用PatchDOCK對接程序分析（http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/PatchDock/），得到200個對接復合物，進一步利用其FireDock的refine模塊，獲得綜合打分排序的復合物，同樣進行能量最小化和分子動力學模擬驗證。驗證后的對接復合物進行ASA計算，分析毒素和受體參與結合的區域；并進一步通過Ligplot分析毒素和受體結合區域中參與互作的氨基酸位點。

1.2.6 關鍵氨基酸位點預測 利用DrugscorePPI在線服務（http://cpclab.uni-duesseldorf.de/dsppi/main.php），提交毒素-受體對接復合物pdb文件，基于丙氨酸掃描突變，計算出突變前后結合自由能的變化值，當結合自由能的變化值＞2 kJ·mol-1時被認為是關鍵氨基酸位點，通過計算分別預測出毒素和受體參與結合的關鍵氨基酸位點。

2 結果

2.1 小菜蛾mALP基因擴增

提取小菜蛾4齡幼蟲中腸總RNA，利用反轉錄試劑盒成功制備cDNA。通過針對mALP全長設計的引物，PCR擴增獲得了大小約為1 655 bp的條帶，與預期大小一致（圖1）。

M：DNA Marker；1：mALP 基因PCR擴增產物 PCR product of mALP gene

2.2 重組質粒pET-26b-mALP的構建及鑒定

將純化后的PCR產物連接至pET-26b載體中，經PCR驗證條帶大小與預期大小一致（約1 700 bp）（圖2-A），經Ⅰ和Ⅰ酶切得到mALP片段（圖2-B），并對其序列進行測定。序列分析結果表明該小菜蛾mALP基因編碼區序列為1 632 bp，編碼567個氨基酸，理論預測分子量約為62 kD。經NCBI網站Blastp搜索比對后發現與已公布的小菜蛾mALP序列一致性為99%（僅有6個氨基酸存在差異）（圖2-C）。說明pET-26b-mALP載體構建成功。

2.3 pET-26b-mALP在BL21中的誘導表達和Ligand blot鑒定

將鑒定無誤的陽性克隆在25℃，轉速220 r/min，終濃度為0.5 mmol·L-1IPTG條件下，誘導培養16 h進行表達。經SDS-PAGE電泳發現，全菌液在預期大小處出現明顯的特異性蛋白條帶（62 kD）并經Western blot證實了成功表達出小菜蛾mALP蛋白（圖3-A、3-B），Ligand blot試驗則進一步證實了通過原核表達的mALP具有與Cry1Ac體外結合的能力（圖3-C）。

2.4 小菜蛾mALP同源建模及模型評價

通過SWISS-MODEL和I-TASSER，分別構建了mALP的三維結構模型、能量最小化和分子動力學模擬后，利用在線模型評價方法對其三維結構進行評價比較分析，結果發現I-TASSER方法構建的mALP三維結構最佳（圖4-A）。mALP的三維結構以及與模板的RMSD值為0.24（圖4-B）；經分子動力學模擬，模型構像趨于穩定后（圖4-C）進行模型評價，結果表明構建的模型各項參數指標（表1）均顯示模型是合理可信的，可用于后續分子對接試驗。

M：DNA Marker。A：1：重組質粒PCR產物 PCR product amplified by pET-26b-mALP recombinant plasmid；B：1：pET-26b-mALP重組質粒 pET-26b-mALP recombinant plasmid；2：重組質粒雙酶切產物 Recombinant plasmid digested production by NcoⅠand NotⅠ；C: 本研究mALP（Query）與公布的小菜蛾mALP（Sbjet）序列比對Amino acid sequence alignment between mALP in this study (Query) and mALP in GenBank (GenBank ID: KC841472.2) (Sbjet)

M：蛋白Marker Protein Marker。A、B： 1：pET-26b空載 Empty pET-26b vector；2：誘導表達mALP Expression of mALP after IPTG induction； C：1、2：pET-26b 空載和誘導表達mALP與Cry1Ac毒素和抗體孵育 Expression productions of empty pET-26b vector and mALP were incubated with Cry toxin and anti-Cry toxin antibody；3：誘導表達mALP與CBS緩沖液和抗體孵育 Expression of mALP were incubated with CBS buffer and anti-Cry toxin antibody

圖4 mALP三維結構（A）、與模板（紅色）結構比對（B）、分子動力學模擬-RMSD值（C）及拉氏圖分析（D）

表1 模型評價

2.5 小菜蛾mALP與Cry1Ac分子對接

利用PatchDOCK對接程序分析，得到200個對接復合物，進一步利用其FireDock的refine模塊，獲得綜合打分排序的復合物，同樣經過能量最小化和分子動力學模擬，最終確定最佳的對接復合物（圖5-A）。通過溶劑可及表面積變化值（solvent accessible surface areas，ASA）計算分析發現Cry1Ac毒素Domain II和Domain III的ASA值分別為823 ?2和622 ?2，對結合受體的貢獻相對最重要，其中Loop環2的ASA值為586 ?2，受體中參與結合的氨基酸總的ASA變化值為1186 ?2（表2）。進一步利用Ligplot分析發現毒素和受體分別都有6個氨基酸殘基參與互作，并且都有大量的氨基酸殘基以疏水形式參與結合（圖5-B）。

表2 溶劑可及表面積變化值計算

B：形成氫鍵氨基酸中紅色氨基酸字母與數字代表Cry1Ac毒素，綠色氨基酸字母與數字代表mALP受體；形成疏水性氨基酸中藍色氨基酸字母與數字代表Cry1Ac毒素，黑色氨基酸字母與數字代表mALP受體 In formation of the hydrogen bonds amino acids the red amino acid names and numbers represented as Cry1Ac toxin, the green amino acid names and numbers represented as mALP receptor, respectively. While in formation of the hydrophobic interaction the blue amino acid names and numbers represented as Cry1Ac toxin, the black amino acid names and numbers represented as mALP receptor

2.6 關鍵氨基酸位點預測

經過DrugscorePPI計算預測對接復合物結合區域中主要參與結合的各殘基結合自由能變化值，結果如圖6-A所示，毒素和受體結合位點中分別有3個氨基酸殘基（376ASN、443SER和486SER）和4個氨基酸殘基（452ARG、499THR、502TYR和513TYR）為參與互作的關鍵氨基酸位點（結合自由能的變化值＞2 kJ·mol-1）；這些關鍵氨基酸位點的分布情況如圖6-B所示。

A：DrugscorePPI計算預測復合物中主要參與結合的各殘基結合自由能變化DrugscorePPI calculated the change of binding free energy of each residue in the predicted complexes；B：粉紅色骨架區Pink ribbon region：Cry1Ac毒素 Cry1Ac toxin；紅色球形氨基酸Red spherical amino acids：Cry毒素關鍵氨基酸位點Key amino acids of Cry1Ac toxin；黃色骨架區Yellow ribbon region：mALP receptor；藍色球形氨基酸Blue spherical amino acids：mALP受體關鍵氨基酸位點Key amino acids of mALP receptor

3 討論

目前，利用真核表達體系（桿狀病毒-昆蟲細胞）已成功表達了大量具Bt Cry毒素結合活性的各類受體[26-28]，其中ALP主要依靠真核表達的糖基化位點并利用糖基錨定（GPI-anchored）位點導致細胞穿孔[29]。而原核表達（大腸桿菌）作為應用最為廣泛和成功的系統，也被研究者們應用于Cry毒素受體的表達和功能活性鑒定[30-31]，Chen等利用pET系統成功表達并鑒定了煙芽夜蛾和棉鈴蟲的ALP具有和Cry毒素結合的能力[16,32]。本研究將小菜蛾mALP基因克隆至pET-26b載體進行原核表達和配體印跡試驗，證實了經原核表達的mALP同樣具有與Cry1Ac毒素體外結合的能力。在原核表達試驗中，分別優化了IPTG濃度、誘導溫度、轉速和誘導時間，但在所有優化的條件下，發現mALP均會形成一定量的包涵體，且經尿素溶解蛋白變性后的mALP在配體印跡試驗中同樣具有Cry毒素結合活性（結果未顯示），說明mALP參與毒素結合的關鍵氨基酸表位極有可能是線性表位而非空間構象，這與Fernandez等[33]通過分段表達埃及伊蚊（）ALP受體蛋白區域與Cry11Aa毒素在變形條件下進行配體印記試驗發現ALP具有兩個結合表位區域相一致。

通過比較Cry毒素和靶標昆蟲潛在受體（敏感性和抗性）在結合模式下參與互作氨基酸的變化，對了解毒素-受體作用的分子機理和利用蛋白質工程方法提高Cry毒素殺蟲效果具有重要意義[34-35]。但由于Cry毒素種類繁多以及其在不同昆蟲中的潛在受體不斷被發現且分子量普遍偏大，而目前在蛋白質數據庫（protein data bank，PDB）中僅有十幾種Cry毒素晶體結構和雙翅目昆蟲瘧蚊的氨基肽酶受體APN晶體結構被解析[36-37]。所以利用同源建模和分子對接可為研究毒素-受體結合模式提供強有力的支撐[38-39]。雖然配體印跡試驗是在受體蛋白變形條件下進行的，但結果證實了ALP結合Cry毒素是不依賴其空間構象的，在非變性條件下同樣具備和Cry毒素結合的能力[29]，所以可以利用預測的小菜蛾ALP三維結構與Cry毒素進行分子模擬研究。利用Swiss-Model和I-TASSER分別進行了mALP的三維建模，經過能量最小化和分子動力學分析，以及模型評價分析，最終確定了I-TASSER構建的mALP三維模型最佳，可一步通過分子對接分析其結合表位特征。

通過PatchDOCK和FireDock程序以及分子動力學模擬方法，對Cry1Ac-mALP進行分子對接和對接復合物評價，獲得參數最優的對接復合物，經溶劑可及表面積變化和Ligplot氫鍵及疏水性分析，發現Cry1Ac毒素的結構域II和結構域III均參與受體結合，結構域II中的Loop2和Loop3區域對受體結合的貢獻相對更大；Loop3區域中有2個氨基酸殘基與受體形成氫鍵，而Loop2區域中有多達7個氨基酸與受體可形成疏水結合作用，這對形成穩定和牢靠的復合物至關重要，且與目前報道的Cry毒素Loop2區域主要參與結合ALP的研究相一致[40-41]。mALP有6個氨基酸與毒素形成氫鍵結合，更多的氨基酸則是通過疏水作用與受體結合。經過計算機輔助丙氨酸突變掃描，預測了毒素和受體中參與互作的關鍵氨基酸殘基-“熱點”（Hot-Spots），它們對蛋白質間的結合自由能（?GBind）有著顯著的貢獻，是毒素與受體相互作用主要依賴的少數幾個氨基酸殘基[42]。本研究中預測出的這些熱點殘基可以在接下來的試驗中進一步通過生物分子互作試驗（例如Biacore）驗證，并且mALP的熱點殘基對于今后認知和定位受體的毒素結合區域以及在比較敏感型和抗性昆蟲受體氨基酸變異上有很大幫助，同時Cry毒素中的熱點殘基也是今后利用現代分子生物學手段改造毒素用于提高毒素活力和改善抗性的首要選擇。

4 結論

利用原核表達系統，成功制備了能夠結合Cry1Ac毒素的小菜蛾mALP；預測出小菜蛾mALP的三維結構及與毒素的結合模式，并在此基礎上通過計算機輔助丙氨酸突變掃描獲得毒素-受體結合的關鍵氨基酸位點，為進一步闡明Cry毒素與mALP的互作機制及分子改造增強Cry毒素活性的研究打下基礎。

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（責任編輯 岳梅）

Expression and molecular simulation of alkaline phosphatase receptor of

ZHANG Xiao, HU Xiao-dan, ZHONG Jian-feng, WU Ai-hua, XU Chong-xin, LIU Yuan, ZHANG Cun-zheng, XIE Ya-jing, LIU Xian-jin

(Institute of Food Quality Safety and Detection Research, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Food Quality and Jiangsu Province-State Key Laboratory Breeding Base/Key Laboratory of Control Technology and Standard for Agro-product Safety and Quality, Ministry of Agriculture, Nanjing 210014)

【Objective】The objective of this study is to confirm the binding ability of membrane-bound alkaline phosphatase (mALP) ofwith Cry1Ac toxin using prokaryotic expression and Ligand blot, and to predict toxin-receptor binding region and key amino acid binding sites (hot-spots) employed by homology modeling and docking study of Cry1Ac-mALP binding mode. It will provide a basis for the study of toxin-receptor interaction mechanism and molecular modification to enhance the activity of Cry toxin. 【Method】The mALP offull-length primers were designed and amplified by PCR. The restricted products of mALP and pET-26b (+) were ligated by T4 DNA ligase after the dual-enzyme digestion procedures. The recombinant pET-26b-mALP vectors were transferred into the Trans1-T1 phage resistant chemically competent cells, then picked clones were analyzed by PCR amplification, dual-enzyme digestion and sanger sequencing. The positive recombinant vectors (anchoring the corrected mALP gene) were transferred into theBL21 (DE3) competent cells for prokaryotic expression. The inducible expression products of mALP were transformed onto PVDF membrane. Preparation of mALP and binding activity of Cry1Ac with malp were verified through Western blot and Ligand blot, respectively. Three-dimensional structure of mALP was predicted by homology modeling, molecular dynamics simulation and model evaluation. The toxin-receptor docking complexes were generated by using the PatchDocK and FireDock web-servers with molecular dynamics simulations. The toxin-receptor complex was analyzed to determine the interaction region and the amino acid binding sites, key amino acid residues involved in Cry toxin and ALP receptor by computer-aided alanine mutation scanning tests. 【Result】mALP gene was successfully amplified, followed with the prokaryotic expression of mALP receptor protein. Binding of Cry1Ac toxin with prepared mALP protein was verified. The three-dimensional structure of mALP was successfully obtained by homology modeling, then the Cry toxin-ALP complex was determined. By the changed solvent accessible surface areas calculation and Ligplot analysis, the results showed that the domain II and domain III of Cry toxin were involved in binding to receptor, and Cry toxin and ALP were interacted mainly depending on hydrophobic and hydrogen bonding patterns. Finally, through the computer-aided alanine mutation scanning hot residues analysis, there were three key amino acid residues (376Asn, 443Ser and 486Ser) from Cry toxin and four key amino acid residues (452Arg, 499Thr, 502Tyr and 513Tyr) from ALP were participated in the interaction of toxin-receptor complex, respectively. 【Conclusion】It can be determined that the mALP receptor also has the ability to bind Cry1Ac toxin by prokaryotic expression, the three-dimensional structure of mALP was predicted and the toxin-receptor binding model was studied using molecular simulation.

alkaline phosphatase (ALP); prokaryotic expression; Ligand blot; homology modeling; molecular docking; hot-spots prediction

2016-09-05；接受日期：2016-10-08

國家自然科學基金（31401813、31630061）、江蘇省自然基金-青年基金（BK20140744）、江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地自主研究課題（3201613）

張霄，E-mail：zxwin2008@126.com。通信作者劉賢金，E-mail：jaasliu@jaas.ac.cn