柱前衍生HPLC-UV法測定人工牛黃中豬去氧膽酸含量

楊歡，丁月珠，段天璇，扶宇，王雄飛，王昭懿，袁瑞娟

北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102

柱前衍生HPLC-UV法測定人工牛黃中豬去氧膽酸含量

楊歡，丁月珠，段天璇，扶宇，王雄飛，王昭懿，袁瑞娟

北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102

目的建立柱前衍生HPLC-UV法測定人工牛黃中豬去氧膽酸含量的方法。方法以2-萘基溴甲基酮為衍生試劑、三乙胺為催化劑、60 ℃水浴條件下對豬去氧膽酸進行衍生，采用HPLC-UV法測定人工牛黃中豬去氧膽酸含量。結果當衍生試劑與豬去氧膽酸的摩爾比＞20∶1，催化劑與豬去氧膽酸的摩爾比＞15∶1，在60 ℃水浴條件下反應50 min時，衍生反應完全。豬去氧膽酸在0.1～2 μg范圍內線性關系良好（r=0.999 7），平均回收率為97.85%（RSD=1.6%）。人工牛黃樣品中豬去氧膽酸的含量為4.12%。結論本方法靈敏度高、準確可靠、穩定性和重復性好，可用于測定人工牛黃中豬去氧膽酸的含量。

人工牛黃；豬去氧膽酸；柱前衍生；高效液相色譜法；紫外檢測

人工牛黃由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、牛磺酸、膽紅素、膽固醇、微量元素等加工制成，是天然牛黃的代用品之一［1］，其在中藥制劑中的使用可有效緩解天然牛黃資源短缺。豬去氧膽酸為人工牛黃的特征成分之一，測定其含量可在一定程度上控制人工牛黃的質量，同時豬去氧膽酸也是區別人工牛黃和天然牛黃的指標性成分。由于豬去氧膽酸為末端吸收，無法采用高效液相紫外檢測器進行檢測。目前多采用高效液相蒸發光散射檢測法［2-3］和薄層掃描法［4］測定其含量，但靈敏度較低。雖然采用質譜法測定有非常高的靈敏度，但存在儀器價格昂貴、重復性差等缺點。采用柱前衍生HPLC-UV法可以提高靈敏度，同時普適性強。故本試驗采用柱前衍生后高效液相紫外檢測器檢測，對人工牛黃中豬去氧膽酸的含量進行測定。

1　儀器與試藥

島津高效液相色譜儀（LC-20AT），DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南予華儀器有限公司），電子天平（CPA225D，北京賽多利斯儀器系統有限公司），KQ-300B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），MTN-2800D型氮氣吹干儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）

豬去氧膽酸對照品（純度98%，成都曼斯特生物科技有限公司，中國科學院成都生物研究所，批號MUST-15032804），人工牛黃（產地安徽，批號20110116，購自北京同仁堂），三乙胺（純度為99.0%，天津市福晨化學試劑廠），2-萘基溴甲基酮（純度98%，上海晶純生化科技股份有限公司），水為去離子水，甲醇、乙腈均為色譜純。其他試劑均為分析純。

2　方法

2.1色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-1%磷酸（83∶17，V∶V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：238 nm；進樣量：20 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1豬去氧膽酸標準溶液精密稱取豬去氧膽酸對照品1 mg置1mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋定容至刻度。

2.2.2人工牛黃提取液精密稱取人工牛黃 20 mg 于10 mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度，稱定質量，超聲30 min（功率300 W，工作頻率40 kHz），冷卻至室溫，再次稱定質量，補足減失的質量，即得。

2.2.3衍生試劑溶液精密稱取 2-萘基溴甲基酮63.5 mg于25 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

2.2.4催化劑溶液取三乙胺35.5 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

2.3衍生化反應

取人工牛黃提取液，定容于1 mL容量瓶中，氮氣吹干。加入催化劑溶液 0.1 mL、衍生試劑溶液0.75 mL，用甲醇定容至刻度，60 ℃水浴反應50 min后冷卻到室溫，加甲醇至刻度，按“2.1”項下色譜條件測定反應產物的峰面積。

2.4方法學考察

2.4.1專屬性試驗取催化劑溶液0.1 mL、衍生試劑溶液0.75 mL于1 mL容量瓶中后用甲醇定容到刻度，按“2.1”項下色譜條件記錄色譜圖與人工牛黃衍生化反應后的色譜圖進行對比，見圖1、圖2。衍生試劑及催化劑對衍生產物無干擾，專屬性良好。

圖1　衍生試劑與催化劑HPLC圖

圖2　人工牛黃經衍生后的HPLC圖

2.4.2線性關系考察分別取豬去氧膽酸標準溶液0.005、0.01、0.02、0.05、0.07、0.1 mL于1 mL容量瓶中。按“2.3”項下條件進行衍生化反應，按“2.1”項下色譜條件測定反應產物峰面積。以峰面積對豬去氧膽酸質量作圖，結果豬去氧膽酸在0.1～2 μg范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=1.0×108X-9551 9，r=0.999 7。

2.4.3精密度試驗將人工牛黃提取液按“2.3”項下條件進行衍生化反應后，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積，RSD=2.7%。

2.4.4重復性試驗按照人工牛黃提取液的提取方法制備6份提取液，按“2.3”項下條件進行衍生化反應。按“2.1”項下色譜條件分別進樣，記錄峰面積，RSD=2.3%。

2.4.5穩定性試驗將人工牛黃提取液分別于0、2、4、6、8、12、24 h進行HPLC測定，記錄產物峰面積，RSD=2.4%，表明樣品在24 h內穩定。

2.4.6加樣回收率試驗精密稱取人工牛黃約10 mg，按人工牛黃提取液的方法提取6份提取液，取提取液定容于 1mL容量瓶中，氮氣吹干。分別加入豬去氧膽酸標準溶液33、33、41、41、49、49 μL后按“2.3”項下條件進行衍生化反應，按“2.1”項下色譜條件測定反應產物的峰面積并計算回收率，結果見表1。

表1　豬去氧膽酸加樣回收率試驗

2.5樣品含量測定

取人工牛黃樣品，按上述提取方法和衍生條件反應后，測定豬去氧膽酸衍生產物峰面積，根據回歸方程計算豬去氧膽酸含量，結果表明樣品中豬去氧膽酸的含量為4.12%。

3　討論

3.1衍生反應條件的確定

3.1.1衍生時間取豬去氧膽酸標準溶液0.1 mL于1 mL容量瓶中，加催化劑溶液0.1 mL、衍生試劑溶液0.5 mL，用甲醇定容至刻度，平行操作7份，分別于60 ℃水浴中反應10、20、30、40、50、60、70 min后冷卻到室溫，加甲醇至刻度，按“2.1”項下色譜條件測定反應產物的峰面積，結果見圖3。反應產物的峰面積隨反應時間而增大，反應50 min時達到最大。

圖3　豬去氧膽酸衍生產物峰面積與反應時間的關系

3.1.2催化劑用量取豬去氧膽酸標準溶液0.1 mL 于1 mL容量瓶中，加入衍生試劑溶液0.5 mL后分別加入2～30倍反應物摩爾量的催化劑溶液，用甲醇定容至刻度，60 ℃水浴反應50 min后冷卻到室溫，加甲醇至刻度，按“2.1”項下色譜條件測定反應產物的峰面積，結果見圖4。反應產物的峰面積隨加入催化劑溶液的增大而增大，當催化劑的摩爾量為反應物的10倍后反應產物的峰面積沒有明顯增加。

圖4　豬去氧膽酸衍生產物峰面積與催化劑用量的關系

3.1.3衍生試劑用量取豬去氧膽酸標準溶液0.1 mL 于1 mL容量瓶中，加催化劑溶液0.05 mL后分別加入2～100倍反應物摩爾量的衍生試劑溶液，用甲醇定容至刻度，60 ℃水浴反應50 min后冷卻到室溫，加甲醇至刻度，按“2.1”項下色譜條件測定反應產物的峰面積，結果見圖5。反應產物的峰面積隨加入衍生試劑溶液的增大而增大，當催化劑的摩爾量為反應物的20倍后反應產物的峰面積沒有明顯增加。

圖5　豬去氧膽酸衍生反應產物與衍生試劑用量的關系

3.2高效液相色譜條件確定

衍生化反應后，將衍生產物在200～400 nm波長范圍內紫外掃描，其最大吸收波長為238 nm，故選擇238 nm作為檢測波長。采用甲醇和1%磷酸溶液為流動相，衍生產物的峰形較好。同時，流動相的用量比為甲醇-1%磷酸（83∶17，V∶V）、流速為1.0 mL/min時，可以使衍生產物與雜質峰獲得最佳分離。

4　小結

采用本法測定人工牛黃中豬去氧膽酸含量的結果與其他方法［4-5］相差不大。與其他文獻報道的衍生方法［6-7］相比，本法以價格低廉的溴乙酰化試劑為衍生試劑、三乙胺為催化劑，提供堿性環境，降低了衍生反應的成本。本試驗考察了衍生試劑用量、催化劑用量、反應時間對衍生產物的影響，確定了衍生反應進行完全所需的條件。整個衍生反應可在1 h內完成，利用HPLC-UV法對其進行分離，可在15 min內完成；方法學考察結果顯示本法穩定可靠，可作為人工牛黃中豬去氧膽酸的含量測定的方法。本研究可為其他甾體類等無紫外吸收物質的分析提供依據，是一種靈敏度高、價格低廉、重復性好、快速簡便的分析方法。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2015：5-8.

［2］ 唐元軍.HPLC-ELSD法同時測定豬膽粉中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2010，21（6）：651-653.

［3］ 熊靖.人工牛黃甲硝唑膠囊中主要膽汁酸類成分的 HPLC-ELSD法測定研究［J］.藥物分析雜志，2015，35（6）：1067-1071.

［4］ 葉蓓蓓.薄層掃描法同時測定人工牛黃中膽酸及豬去氧膽酸的含量［J］.藥物分析雜志，2010，30（4）：706-709.

［5］ 馮芳.反相高效液相色譜-蒸發光散射檢測法同時測定人工牛黃中多組分含量［J］.藥學學報，2000，35（3）：216-219.

［6］ 暴梅佳.柱前衍生化高效液相色譜法測定清開消炎片中豬去氧膽酸的含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2010，21（2）：186-188.

［7］ 倪坤儀.反相高效液相色譜法測定牛黃類中成藥中膽汁酸的含量［J］.藥學學報，1994，29（8）：629-633.

Content Determination of Hyodeoxycholic Acid in Artificial Calculus Bovis by Pre-Column Derivatization HPLC-UV Method

YANG Huan， DING Yue-zhu， DUAN Tian-xuan， FU Yu， WANG Xiong-fei，WANG Zhao-yi， YUAN Rui-juan
（School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102， China）

Objective To establish a pre-column derivation HPLC-UV method for the content determination of hyodeoxycholic acid in artificial calculus bovis. Methods The hyodeoxycholic acid was derived by 2-bromo-2’-acetonaphthoneat using triethylamine as the catalyst in 60 ℃ water bath. After that， a HPLC-UV method was established to determine the content of hyodeoxycholic acid in artificial calculus bovis. Results When the derivatising time at 60 ℃ water bath was 50 min， the radio of the molar amount of derived reagents and hyodeoxycholic was over 20∶1 and the radio of catalyst and hyodeoxycholic was over 15∶1； the reaction was completed. The calibration curve was linear within the range of 0.1-2 μg for hyodeoxycholic acid （r=0.999 7）， and the average recovery was 97.85% （RSD=1.6%）. In this sample， the content of hyodeoxycholic is 4.12%. Conclusion The method is with high sensitivity， highly reproducible， reliable and accurate for the content determination of hyodeoxycholic acid in artificial calculus bovis.

artificial calculus bovis； hyodeoxycholic acid； pre-column derivation； HPLC； UV

R284.1

A

1005-5304（2016）10-0092-03

2015-11-07；編輯：陳靜）

國家自然科學基金（81403071）；國家級大學生創新訓練計劃項目（201410026033）；北京中醫藥大學自主選題項目（2013-ZDXKKF-20、2013-YXJXTD-15）

袁瑞娟，E-mail：rjyuance@126.com

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.021