金雀異黃素對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

王玲，劉輝國(guó)

武漢大學(xué)醫(yī)院，湖北 武漢 430071

金雀異黃素對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

王玲，劉輝國(guó)

武漢大學(xué)醫(yī)院，湖北 武漢 430071

目的觀察金雀異黃素對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響，探討其改善肺纖維化的作用機(jī)制。方法CCK-8法檢測(cè)不同濃度GEN和/或TGF-β1干預(yù)細(xì)胞72 h后的活性；RT-PCR檢測(cè)上皮及間質(zhì)標(biāo)記物的轉(zhuǎn)變以及在轉(zhuǎn)變過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子；Western blot檢測(cè)p38及JNK信號(hào)通路的變化。結(jié)果TGF-β1連續(xù)刺激A549細(xì)胞72 h可誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞表型，表現(xiàn)出更多間質(zhì)標(biāo)記物升高，內(nèi)皮標(biāo)記物降低；RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，金雀異黃素可呈濃度依賴(lài)性逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，金雀異黃素與TGF-β1協(xié)同刺激A549細(xì)胞24 h可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)p38及JNK信號(hào)通路的磷酸化水平。結(jié)論金雀異黃素可抑制TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT而發(fā)揮抗纖維化的作用。

金雀異黃素；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；A549；肺纖維化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種以進(jìn)行性肺纖維化為主要臨床特點(diǎn)的疾病，其主要表現(xiàn)為肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞的大量聚集，破壞肺泡結(jié)構(gòu)導(dǎo)致肺功能下降最終導(dǎo)致死亡。有研究表明，從IPF患者中分離出的成纖維細(xì)胞具有異質(zhì)性，多種細(xì)胞如骨髓和肺泡上皮細(xì)胞在條件刺激下可轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞［1-2］。其中肺泡上皮細(xì)胞在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）刺激下發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）而形成的成纖維細(xì)胞在IPF中占據(jù)一定比例，對(duì)肺纖維化的進(jìn)展發(fā)揮重要作用，抑制EMT可顯著改善肺纖維化，繼而改善肺功能，但目前臨床尚缺乏特異性的抗纖維化治療藥物。

金雀異黃素（genistein，GEN）是一種存在于豆科植物和齒狀植物中的天然異黃酮化合物，體外實(shí)驗(yàn)研究顯示，其具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用［3］。張氏等［4］研究顯示，GEN具有抑制大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖的作用；顧氏等［5］研究顯示，GEN對(duì) D-半乳糖損傷的乳鼠皮膚細(xì)胞成纖維細(xì)胞增殖亦具有抑制作用。但GEN是否影響肺纖維化中成纖維細(xì)胞的增殖以及EMT現(xiàn)象尚未見(jiàn)研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察GEN對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞在 TGF-β1誘導(dǎo)下發(fā)生EMT的影響，探討其改善肺纖維化的作用機(jī)制，為進(jìn)一步臨床治療肺纖維化提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥物和細(xì)胞

GEN，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，純度≥98%，貨號(hào)446-72-0。A549人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù)刺激均在獨(dú)立的細(xì)胞房中進(jìn)行，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5.0%CO2培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)次融合狀態(tài)時(shí)以0.25%胰蛋白酶消化，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要接種于不同的培養(yǎng)皿中。分組誘導(dǎo)前以無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓24 h，減少血清對(duì)刺激因素的影響，同時(shí)饑餓處理可使細(xì)胞同步化。

1.2主要試劑與儀器

高糖DMEM basic（1×）培養(yǎng)基、新生小牛血清（NBS）、胰酶，Gibco；TGF-β1，PEPROTECH公司；CCK-8試劑盒，日本同仁化學(xué)研究所；RT-PCR試劑盒，Roche；p-p38 MAPK、P38、p-JNK、JNK、GAPDH，Cell Signaling Technology公司。多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)Synergy HT，美國(guó)BioTek公司；恒溫培養(yǎng)箱，日本 SANYO公司；紫外分光光度計(jì) NANODROP 2000c，Thermo scientific；RT反轉(zhuǎn)錄儀器Veriti 96 well Thermal Lycler，Applied Biosystems公司；實(shí)時(shí)定量PCR儀Light Lycler 480，Roche公司；倒置相差顯微鏡，日本OLYMPUS。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞處理和分組

待A549細(xì)胞貼壁融合達(dá)60%～70%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗，加入饑餓液，置于溫箱4 h后置換為含 TGF-β1（10 ng/mL）饑餓液（DMEM+ 0.2%NBS），重新置于溫箱中培養(yǎng)，24 h換液1次，72 h后取出蛋白質(zhì)和RNA樣本。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、TGF-β1組、TGF-β1+GEN 1 μmol/L組、TGF-β1+ GEN 5 μmol/L組、TGF-β1+GEN 10 μmol/L組和GEN 10 μmol/L組。

2.2CCK-8法檢測(cè)

細(xì)胞被接種至96孔板中，每孔100 μL，接種密度大約在2×105個(gè)/mL，置于溫箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)基更換為無(wú)血清的培養(yǎng)基饑餓24 h，采用不同處理因素干預(yù)72 h后，將96孔板培養(yǎng)基換為含有10 μL CCK-8的無(wú)血清培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)在溫箱中孵育2～2.5 h后于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)。嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明進(jìn)行操作。

2.3Western blot檢測(cè)

冰上裂解細(xì)胞10 min，置于1.5 mL離心管，超聲裂解儀5 kHz裂解10～15 s，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，將上清液移至新的離心管，采用BCA定量法檢測(cè)蛋白濃度并將蛋白濃度調(diào)整一致后置于煮沸儀上將其變性。每組樣本混勻后取10 μL行10% SDS-PAGE凝膠電泳，檢測(cè)內(nèi)參指標(biāo)GAPDH，根據(jù)各個(gè)樣本的光密度（OD）值調(diào)整上樣劑量，使用調(diào)整后的上樣劑量再行凝膠電泳，使其GAPDH的OD值保持一致，后每組以校正后的上樣劑量進(jìn)行凝膠電泳，將蛋白以100 V、90 min移至PVDF膜，用一抗封閉液（1.5 g牛血清白蛋白溶解于50 mL TBST中）封閉12 h，一抗包括p-p38、p38、p-JNK、JNK，然后用TBST（1 L TBS溶液+1 mL Tween20）洗膜3次，將其放入對(duì)應(yīng)的加有二抗的二抗稀釋液（脫脂奶粉溶解于TBST緩沖液中配成2%～5%的液體）中避光孵育1 h，二抗為Alexa Fluor?488 goat anti- Rabbit IgG，再用 TBST洗滌 3次，檢測(cè)目的條帶，應(yīng)用Odyssey圖像分析軟件檢測(cè)各組蛋白的OD值。

2.4RT-PCR檢測(cè)

細(xì)胞以不同因素處理后，棄去培養(yǎng)基，以Trizol法提取細(xì)胞總 RNA，采用紫外分光光度法測(cè)定其含量與純度。根據(jù)樣本所測(cè)濃度，取適當(dāng)劑量將各個(gè)樣本濃度調(diào)整一致后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參照，采用20 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃、2 min；1個(gè)循環(huán)，94 ℃、40 ；25～35個(gè)循環(huán)；50 ℃～65 ℃、40 s，72 ℃、1 min，72 ℃、5 min，1個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。

表1　RT-PCR引物序列

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4　結(jié)果

4.1金雀異黃素對(duì)A549細(xì)胞活性的影響

GEN干預(yù)72 h后，與對(duì)照組比較，GEN組、GEN 和TGF-β1的混合液組A549細(xì)胞不同濃度細(xì)胞的活性均無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

4.2金雀異黃素對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo) A549細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

與TGF-β1組比較，GEN組與TGF-β1協(xié)同刺激A549細(xì)胞 72 h可抑制間質(zhì)標(biāo)記物 CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、Vimentin、Fibronectin的基因表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin的基因表達(dá)，呈濃度依賴(lài)性，見(jiàn)表3。對(duì)照組鏡下細(xì)胞連接緊密，相互黏附性較強(qiáng)，表現(xiàn)為鋪路石樣；TGF-β1刺激72 h后細(xì)胞間緊密連接消失，間隙變大，形態(tài)轉(zhuǎn)化為狹長(zhǎng)形、紡錘形；TGF-β1與GEN（10 μmol/L）共同刺激72 h后，細(xì)胞形態(tài)又重新保持上皮細(xì)胞特有的形狀；單用GEN（10 μmol/L）刺激72 h細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組形態(tài)相似。見(jiàn)圖1。

表2　各組A549細(xì)胞不同濃度細(xì)胞活性比較（±s）

表2　各組A549細(xì)胞不同濃度細(xì)胞活性比較（±s）

組別　n　0 μmol/L　1 μmol/L　5 μmol/L　10 μmol/L GEN組　5　1.00±0.13　1.01±0.12　0.99±0.05　0.99±0.11 TGF-β1+GEN組　5　1.00±0.19　1.00±0.07　1.06±0.12　1.09±0.12對(duì)照組　5　1.00±0.00　1.00±0.00　1.00±0.00　1.00±0.00

表3　各組A549細(xì)胞上皮及間質(zhì)標(biāo)記物mRNA表達(dá)比較（±s）

表3　各組A549細(xì)胞上皮及間質(zhì)標(biāo)記物mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與TGF-β1組比較，##P＜0.01

組別　n　劑量/（μmol/L）　Collagen Ⅰ　Collagen Ⅲ　Vimentin　Fibronectin　E-cadherin對(duì)照組　9　1.00±0.09　1.00±0.10　1.00±0.10　1.00±0.07　1.00±0.08 TGF-β1　9　3.56±0.46**　3.21±0.45**　2.12±0.14**　3.42±0.32**　0.21±0.06**TGF-β1+GEN組　9　1　2.56±0.34##　2.75±0.43##　1.74±0.19##　2.69±0.29##　0.45±0.09##TGF-β1+GEN組　9　5　2.01±0.34##　1.96±0.18##　1.41±0.18##　2.11±0.16##　0.55±0.08##TGF-β1+GEN組　9　10　1.43±0.09##　1.45±0.18##　1.26±0.19##　1.36±0.11##　0.89±0.09##GEN組　9　10　1.03±0.07　1.05±0.09　1.04±0.05　1.07±0.07　0.99±0.05

圖1　各組A549細(xì)胞病理形態(tài)（×100）

4.3金雀異黃素對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)的 A549細(xì)胞p38、JNK信號(hào)通路磷酸化水平的影響

GEN與TGF-β1協(xié)同刺激A549細(xì)胞24 h可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)p38及JNK信號(hào)通路的磷酸化水平。結(jié)果見(jiàn)圖2、表4。

圖2　各組A549細(xì)胞蛋白表達(dá)免疫印跡電泳圖

表4　各組A549細(xì)胞p-p38、p-JNK蛋白表達(dá)比較（±s，OD值）

表4　各組A549細(xì)胞p-p38、p-JNK蛋白表達(dá)比較（±s，OD值）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與TGF-β1組比較，##P＜0.01

組別　n　劑量/（μmol/L）p-p38　p-JNK對(duì)照組　3　1.00±0.07　1.00±0.08 TGF-β1組　3　2.78±0.36**　2.10±0.24**TGF-β1+GEN組　3　10　1.66±0.19##　1.39±0.18##GEN組　3　10　1.04±0.07　0.99±0.05

4.4金雀異黃素對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo) A549細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子snail1、snail2、twist1、twist2基因表達(dá)的影響

TGF-β1干預(yù)A549細(xì)胞24 h，snail1、snail2、 twist1、twist2基因表達(dá)較對(duì)照組明顯升高（P＜0.01）；GEN與TGF-β1協(xié)同作用則可顯著下調(diào)上述4種轉(zhuǎn)錄因子（P＜0.01）；GEN組對(duì)以上信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄因子則無(wú)明顯影響（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　各組A549細(xì)胞snail1、snail2、twist1、twist2 mRNA表達(dá)比較（±s）

表5　各組A549細(xì)胞snail1、snail2、twist1、twist2 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與TGF-β1組比較，##P＜0.01

組別　n 劑量/（μmol/L）　snail1　snail2　twist1　twist2對(duì)照組　9　1.00±0.10　1.00±0.11　1.00±0.08　1.00±0.09 TGF-β1組　9　2.38±0.48**　2.11±0.35**　3.29±0.36**　1.92±0.37**TGF-β1+GEN組 9　10　1.41±0.18##　1.36±0.21##　1.89±0.25##　1.37±0.19##GEN組　9　10　1.03±0.03　1.04±0.02　0.98±0.08　0.99±0.13

5　討論

肺泡上皮細(xì)胞通過(guò)EMT機(jī)制轉(zhuǎn)化而來(lái)的成纖維細(xì)胞在肺纖維化中發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1連續(xù)刺激A549細(xì)胞72 h可誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞表型，表現(xiàn)出更多的間質(zhì)標(biāo)記物升高，而上皮標(biāo)記物降低。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，GEN可呈濃度依賴(lài)性逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，GEN與TGF-β1協(xié)同刺激A549細(xì)胞24 h可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)p38及JNK信號(hào)通路的磷酸化水平。以上結(jié)果均提示GEN可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞發(fā)生EMT而發(fā)揮抗纖維化的作用。

近年來(lái)，隨著對(duì)人體器官纖維化研究的逐步深入，上皮細(xì)胞在某些病理情況發(fā)生的EMT現(xiàn)象也逐漸得到研究者的關(guān)注。上皮細(xì)胞在病理因素如TGF-β1的長(zhǎng)期慢性刺激下可以失去其原有的極性，細(xì)胞間的緊密連接逐漸消失，最終獲得一定的遷移和游走能力，具有間質(zhì)細(xì)胞的表型，對(duì)肺纖維化起到一定的促進(jìn)作用，抑制 EMT則可顯著改善肺功能［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1（10 ng/mL）連續(xù)刺激A549細(xì)胞72 h后，細(xì)胞形態(tài)由連接緊湊的鋪路石樣轉(zhuǎn)化為松散狹長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞形狀。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，間質(zhì)標(biāo)記物 CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、Vimentin、Fibronectin表達(dá)均上調(diào)，而上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)則下調(diào)，由此可以判斷 TGF-β1可以誘導(dǎo) A549細(xì)胞發(fā)生EMT，而TGF-β1與GEN同時(shí)干預(yù)A549細(xì)胞72 h則可呈濃度依賴(lài)性逆轉(zhuǎn)EMT，上調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)記物，下調(diào)間質(zhì)標(biāo)記物。

無(wú)論是永生化的大鼠肺泡型上皮細(xì)胞；還是從大鼠分離、培養(yǎng)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，以及人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞均可通過(guò)TGF-β1誘導(dǎo)上皮細(xì)胞EMT，出現(xiàn)成肌纖維細(xì)胞的表型［7］。TGF-β1在肺纖維化EMT過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。本研究檢測(cè)了p38及JNK信號(hào)通路以及其下游的靶分子的表達(dá)，包括 snail1、 snail2、twist1、twist2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGF-β1刺激A549細(xì)胞24 h可顯著升高p38及JNK信號(hào)通路的磷酸化水平，其下游靶分子snail1、snail2、twist1、twist2表達(dá)均上調(diào)，而TGF-β1與GEN聯(lián)合作用時(shí)，則可顯著降低p38及JNK信號(hào)通路的磷酸化水平以及抑制其下游的靶分子。因此，我們認(rèn)為GEN可能通過(guò)抑制p38及JNK信號(hào)通路以及其下游的靶分子的表達(dá)抑制A549細(xì)胞發(fā)生EMT。

本研究結(jié)果表明，GEN可明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞發(fā)生EMT，為GEN的大體研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但本研究未能闡明其具體的作用機(jī)制，這有待于進(jìn)一步完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

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Effects of Genistein on Epithelium-Mesenchyme Transition of Alveolar Type Ⅱ Cells

WANG Ling， LIU Hui-guo
（The Hospital of Wuhan University， Wuhan 430071， China）

Objective To investigate the effects of genistein on the epithelium-mesenchyme transition of alveolar type II cells； To discuss its mechanism of improving pulmonary fibrosis. Methods The activity of genistein with different concentrations and TGF-β1 intervention cells after 72 h were determined by CCK-8 method； epithelial and mesenchymal markers as well as the key regulatory factors in the transformation process were determined by RT-PCR； changes of p38 and JNK signaling pathways were determined by Western blot. Results The A549 cells were transformed into fibroblast phenotype stimulated by TGF-β1 for 72 h； mesenchymal markers increased and endothelial marker decreased. The results of RT-PCR indicated that genistein inhibited this phenomenon in a concentration-dependent manner. The results of Western blot showed that， genistein possibly inhibited the epithelial-mesenchymal transition through inhibiting the phosphorylation of p38 and JNK signaling pathways and its downstream transcription factors. Conclusion Genistein has anti-fibrosis effects through inhibiting A549 cells undergoing epithelial-mesenchymal transition.

genistein； epithelial-mesenchymal transition； A549； pulmonary fibrosis； TGF-β1

R285.5

A

1005-5304（2016）10-0063-04

2016-02-23；編輯：華強(qiáng)）

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.015