超高效液相色譜串聯質譜法測定豆芽中4-氯苯氧乙酸的含量

史曉磊

(上海德諾產品檢測有限公司，上海 200436)

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超高效液相色譜串聯質譜法測定豆芽中4-氯苯氧乙酸的含量

史曉磊

(上海德諾產品檢測有限公司，上海 200436)

[目的]采用超高效液相色譜串聯質譜法建立豆芽中4-氯苯氧乙酸的定性定量分析方法。[方法]樣品經0.01 mol/L氫氧化鈉溶液提取，Oasis HLB固相萃取小柱凈化，C18色譜柱分離，乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相，采用電噴霧離子源多反應監測模式下液相色譜串聯質譜法檢測，基質曲線外標法定量。[結果]在最佳檢測條件下，4-氯苯氧乙酸在20～500 μg/L線性關系良好，相關系數為0.998 1，檢出限(S/N=3)為20 μg/kg。在加標水平為20、60、100 μg/kg時的平均加標回收率分別為87.62%、102.10%和100.00%，其相對標準偏差(RSD)分別為3.48%、4.92%和6.59%。[結論]該方法具有靈敏度高、準確度和穩定性良好、操作簡捷等的特點，能夠滿足殘留分析的要求。

超高效液相色譜串聯質譜法(UPLC-MS/MS)；固相萃取(SPE)；豆芽；4-氯苯氧乙酸

4-氯苯氧乙酸，又稱對氯苯氧乙酸鈉，作為一種植物生長調節劑，能有效地提高豆芽產量和質量。很多不法商販為了利益，違法國家規定，在生產豆芽時繼續添加4-氯苯氧乙酸。目前，關于豆芽中4-氯苯氧乙酸的含量分析，大多采用高效液相色譜法[1-8]，該方法靈敏度高、分離效果好、定量準確，已被證明是一種成熟的分析方法。然而采用液相色譜進行分析時，被測物與干擾物在色譜柱中具有相同保留時間的現象時有發生，對易污染的樣品易造成假陽性。近2年也有研究采用離子色譜法[9]、液相色譜串聯質譜法進行測定[10-12]。筆者利用目前國際上最為先進和普遍采用的殘留檢測技術(LC/MS/MS)和固相萃取(SPE)樣品凈化前處理技術，建立了豆芽中4-氯苯氧乙酸殘留量的液相色譜-質譜/質譜(LC/MS/MS)檢測方法和陽性確證方法。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑超高效液相色譜-質譜/質譜儀配有電噴霧離子源(UPLC-MS/MS-ESI)(美國Waters公司)；Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm i.d.× 100 mm，1.7 μm)和Oasis HLB 固相萃取小柱(60 mg，3 mL)均購自美國Waters公司；電子分析天平(精度為0.0001 g，瑞士METTLER TOLEDO公司)；電子分析天平(精度為0.01 g，德國Sartorius ME公司)；高速勻漿機(德國IKA T18，3 500～24 000 r/min)；渦旋振蕩器(美國talboys 230V，500～2 500 r/min)；固相萃取儀(安譜公司)；冷凍離心機和超純水儀(美國Thermo Fisher公司)。4-氯苯氧乙酸標準品購于Dr.Ehrenstorfer(德國)；甲醇(德國Merck KGaA公司)、乙腈(Sigma公司)、甲酸(Sigma公司)均為HPLC純；磷酸(H3PO4)、氫氧化鈉(NaOH)為分析純(中國醫藥上海化學試劑公司)；pH試紙(中國醫藥上海化學試劑公司)；試驗用水為超純水。

1.2樣品前處理

1.2.1樣品提取。稱量待測樣品5 g(精確至0.01 g)置于50 mL離心管中，加入10 mL 0.01 mol/L氫氧化鈉溶液，高速勻漿2 min提取，然后在8 000 r/min下離心5 min，將上清液轉移至25 mL容量瓶中。殘渣中再加入10 mL 0.01 mol/L氫氧化鈉溶液，按上述方法重復提取一次，合并2次提取溶液，用0.01 mol/L氫氧化鈉溶液定容至刻度，混勻。準確移取10.0 mL提取液，用50%磷酸溶液調節提取液pH為2.5±0.2，待凈化用。

1.2.2樣品凈化。將全部樣品提取液通過已活化(3 mL甲醇、3 mL水)的Oasis HLB固相萃取小柱，上樣后再用3 mL磷酸水溶液淋洗，淋洗后在固相萃取裝置上真空抽干水分10 min，經4 mL甲醇洗脫，收集至10 mL玻璃試管中，40 ℃氮氣吹干，加入1.0 mL 30 %甲醇水溶液，充分旋渦溶解，經0.22 μm濾膜過濾，待LC-MS/MS分析。

1.3儀器條件

1.3.1色譜條件。流動相的組成和梯度見表1。

1.3.2質譜條件。采用1.0 mg/L 4-氯苯乙酸標準溶液在負離子模式下進行母離子全掃描，確定其分子離子，并對儀器電離電壓、錐孔電壓、離子源溫、碰撞能量等參數進行優化。

離子化模式：電噴霧電離(負離子模式)；質譜掃描方式：多反應監測(MRM)；離子源溫度：150 ℃；毛細管電壓：1.5 kV；脫溶劑溫度：400 ℃；脫溶劑氣流：800 L/h；碰撞氣：氬氣。4-氯苯氧乙酸的質譜參數：母離子(m/z)185.1，子離子(m/z)126.9*、110.9，錐孔電壓-18、-18V，碰撞能量-16、-16V。

表1　流動相的組成和梯度

2　結果與分析

2.1樣品的凈化根據豆芽基質的特點，采用Oasis HLB固相萃取柱凈化，并對其凈化條件進行試驗，以達到Oasis HLB固相萃取柱對4-氯苯氧乙酸分離的最佳凈化效果。向空白豆芽基質中加入一定濃度的4-氯苯氧乙酸標準工作溶液，并按優化后的方法通過Oasis HLB固相萃取小柱，收集活化時所用的甲醇、水以及樣品流出液、淋洗液和洗脫液于不同試管中，分別檢測各流出液中4-氯苯氧乙酸的含量和回收率，以確定Oasis HLB固相萃取小柱對4-氯苯氧乙酸凈化的洗脫液最佳收集體積。由圖1可知，4-氯苯氧乙酸在Oasis HLB固相萃取小柱上在20 mL前完全流出。因此，選擇4 mL洗脫液可最大程度地除去豆芽基質的干擾，同時保證4-氯苯氧乙酸的回收率符合檢測要求。

圖1　Oasis HLB固相萃取小柱洗脫曲線Fig.1　Elution curve of solid phase extraction of Oasis HLB

2.2色譜條件的優化色譜柱的選擇：為了有利于色譜峰的分離及峰形的改善，分別比較2種色譜柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱和Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱對4-氯苯氧乙酸分離程度和響應值的影響。經試驗證明，使用C18色譜柱分離效果更好，4-氯苯氧乙酸響應值更高。

流動相的選擇：在流動相中加入酸性物質或者緩沖鹽，可以增強待測物在色譜柱上的保留效果，并提高分離度，有效改善峰形，比較4-氯苯氧乙酸在3種流動相乙腈-甲酸銨、乙腈-0.1%甲酸水和乙腈-乙酸銨中的分離效果，發現使用乙腈-0.1%甲酸水溶液做流動相時能更好地將待測組分與豆芽基質最大限度地分開。

4-氯苯氧乙酸標準品和豆芽中添加4-氯苯氧乙酸標樣的提取離子色譜見圖2。

圖2　4-氯苯氧乙酸標準品(A)和樣品加標(B)提取離子色譜圖Fig.2　Extraction ion chromatograms of 4-chlorophenoxyacetic acid standard substances(A)，blank bean sprouts sample(B)and fortified sample with 4-chlorophenoxyacetic acid(C)

2.34-氯苯氧乙酸的檢出限和線性范圍用空白豆芽樣品作為基質溶液逐級稀釋標準工作溶液，以驗證方法的靈敏度，以信噪比(S/N)為3∶1時的濃度確定為檢出限(LOD)，并配制一系列濃度的標準工作溶液，采用上述色譜條件進行測定，以定量離子的峰面積Y為縱坐標，濃度X(μg/L)為橫坐標進行線性回歸分析，重復6次，取平均值。結果表明，該方法4-氯苯氧乙酸的最低檢出限為20 μg/kg，4-氯苯氧乙酸標準溶液濃度在20～500 μg/L與響應值線性關系良好，回歸方程為Y=6.635 66x+85.559，相關系數r=0.998 1。2.4方法的準確度和精密度在不含4-氯苯氧乙酸的豆芽樣品中加入標準工作溶液，配制20、60、100 μg/kg 3個水平的加標樣品，按優化后的提取方法和色譜條件進行添加回收率試驗，結果見表3。由表3可知，在加標水平為20、60、100 μg/kg時平均回收率分別為87.62%、102.10%和100.00%，其RSD分別為3.48%、4.92%和6.59%。表明該研究采用的提取、凈化、檢測方法具有較高的準確度和較好的重復性，均可滿足4-氯苯氧乙酸在豆芽中殘留分析的要求。

表3豆芽中4-氯苯氧乙酸標樣添加回收率

Table 3Average recovery rate of 4-chlorophenoxyacetic acid in bean sprouts

添加水平Spikedlevelμg/kg試驗號Testcode檢測值Detectedvaluμg/kg回收率Recoveryrate%平均回收率Averagerecoveryrate∥%相對標準偏差RSD%20118.2391.1387.623.48218.2691.32317.2286.10416.9084.52517.5987.93616.9484.7160163.68106.13102.104.92257.7496.24362.78104.64460.82101.36557.7496.24664.78107.96100191.5091.50100.006.592101.73101.733102.45102.45492.1992.195106.85106.856105.26105.26

2.5樣品分析應用該方法對市面上購買的20組豆芽樣品進行檢測，結果其中2組含有4-氯苯氧乙酸，殘留量分別為40.97和29.36 μg/kg。在實驗室內分別培育10組不含目標化合物的黃豆芽、綠豆芽樣品，采用該方法進行檢測，未發現有4-氯苯氧乙酸殘留，證明該方法在實踐中具有可操作性。

3　結論

該研究采用氫氧化鈉溶液提取，經Oasis HLB固相萃取柱凈化，液相色譜串聯質譜法測定，最終建立了固相萃取-超高效液相色譜串聯質譜法測定豆芽中4-氯苯氧乙酸殘留量的方法。經驗證該方法能夠有效地檢測4-氯苯氧乙酸在豆芽樣品中的殘留，并具有靈敏度高、準確度和穩定性良好、操作簡捷等特點，滿足豆芽樣品中4-氯苯氧乙酸殘留分析的要求，同時為4-氯苯氧乙酸在其他植物源食品中的殘留分析提供參考。

[1] 北京市海淀區產品質量監督檢驗所(國家食品質量安全監督檢驗中心).豆芽中4-氯苯氧乙酸 6-芐基腺嘌呤 2，4-滴 赤霉素 福美雙的測定：DB11/T 379—2006[S].北京：北京市質量技術監督局，2006.

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Determination of 4-Chlorophenoxyacetic Acid in Bean Sprout by UPLC-MS/ MS

SHI Xiao-lei

(Shanghai DtsChina Co., Ltd., Shanghai 200436)

[Objective] To establish a qualitative and quantitative analysis method for 4-chlorophenoxyacetic acid in bean sprout by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS). [Method] The sample was extracted with 0.01 mol/L sodium hydroxide solution, and cleaned up with Oasis HLB. The separations were performed on a C18 column, with a mobile phase of 0.1% formic acid aqueous solution-acetonitrile and detected by positive-ion electrospray ionization mode and multi-reaction monitoring (MRM) mode. [Result] Under the optimal test condition, 4-chlorophenoxyacetic acid showed good linear relationship within the range of 20 -500 μg/L, with correlation coefficient of 0.998 1. The limit of detection(S/N=3) was 20.0 μg/kg. The average recovery rates at three spiked levels of 20, 60, 100 μg/kg were 87.62%, 102.10% and 100.00%, respectively. The relative standard deviations (RSD) were 3.48%、4.92%and 6.59%, respectively. [Conclusion] This method had the characteristics of high sensitivity and accuracy, which can meet the requirement of retention analysis.

UPLC-MS/MS; Solid phase extraction; Bean sprout; 4-Chlorophenoxyacetic acid

史曉磊(1988- )，男，黑龍江黑河人，助理工程師，碩士，從事質譜分析研究。

2016-07-04

TS 207

A

0517-6611(2016)24-080-02