鰹魚骨硫酸軟骨素提取工藝研究

陳 思， 張小軍， 嚴忠雍， 李佩佩， 方 益

(浙江省海洋水產研究所，浙江省海水增養殖重點實驗室，浙江舟山 316100)

?

鰹魚骨硫酸軟骨素提取工藝研究

陳 思， 張小軍*， 嚴忠雍， 李佩佩， 方 益

(浙江省海洋水產研究所，浙江省海水增養殖重點實驗室，浙江舟山 316100)

[目的]以鰹魚骨為原料，對魚骨硫酸軟骨素提取方法進行研究。[方法]以硫酸軟骨素提取率為評價指標，通過單因素和正交試驗優化鰹魚骨硫酸軟骨素的提取條件。[結果]在酶添加量2.5%(木瓜蛋白酶:胰蛋白酶為1∶2)、料液比1∶20、提取溫度80 ℃、pH 6.5下浸提24 h、超聲處理30 min，魚骨硫酸軟骨素的提取率達2.86%，純度為90.0%。理化分析顯示，鰹魚骨硫酸軟骨素顏色潔白，水分含量9.2%，氨基己糖含量30.1%，氮含量3.05%，葡萄糖醛酸含量26.9%。通過紅外光譜分析，確定樣品為硫酸軟骨素C。[結論]利用優化工藝提取鰹魚骨中的硫酸軟骨素具有可行性，在鰹魚加工副產物的高值化利用中具有一定的應用前景。

鰹魚骨；硫酸軟骨素；提取；酶解；超聲

硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，簡稱CS)是關節軟骨處蛋白多糖形成所必需的一類糖氨聚糖，廣泛分布于人和動物的骨骼、軟骨、肌腱、韌帶和血管壁等組織中[1]。硫酸軟骨素具有增強機體免疫、抗關節炎[2-4]、調節血管生成、降血脂[5]、抗病毒[6]、抗凝血[7-9]、抗腫瘤[10-11]等生物活性，主要作為處方藥用于治療風濕和類風濕疾病[12]。此外，硫酸軟骨素在醫藥、保健食品、美容化妝品等領域具有廣闊的應用前景。硫酸軟骨素主要從豬、牛、羊等畜類軟骨組織中提取獲得，來源和工藝[13]較為單一。近年來，海洋生物作為新的藥用資源日漸受到重視，已從孔鰩[14]、魷魚[15]、鯊魚[16]、鮟鱇魚[17]中提取硫酸軟骨素，但對于其他海洋魚類硫酸軟骨素的研究鮮見報道。鰹魚(Katsuwonuspelamis)，屬硬骨魚綱 (Osteichthyes)鱸形總目(Pereiformes)鯖科(Scombridae)鰹屬(Katsuwonus)，海洋中上層魚類，在我國東海和南海的捕撈量大。鰹魚除鮮銷外，主要加工成冷凍魚片或罐裝食品銷售，加工過程中產生的副產物占總重量的50%～70%[18]。魚骨占副產物的比例較大，有待進一步開發利用。筆者以鰹魚骨為原料，在選擇復合蛋白酶的基礎上，對魚骨硫酸軟骨素的提取效率進行研究，以期為鰹魚產品加工副產物的高值化利用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器鰹魚骨，舟山水產公司提供；硫酸軟骨素標準品，購于美國Sigma公司；木瓜蛋白酶、胰蛋白酶，購于國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純，購于華東醫藥公司。

723分光光度計，上海第三分析儀器廠；pH計，杭州華光無線電廠；旋轉蒸發儀，鄭州科工貿有限公司；恒溫水浴箱，上海醫療器械五廠；AVATAR-360型紅外光譜儀，美國尼高力公司；攪拌機，杭州儀表電機廠；離心沉淀機，上海醫用分析儀器廠；冷凍干燥儀，北京博醫康實驗儀器公司。

1.2方法

1.2.1原料處理。新鮮鰹魚骨將余肉剔凈，濕骨60 ℃烘干后粉碎成粉末，4 ℃干燥保存。

1.2.2提取工藝流程。魚骨干品→木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和蒸餾水提取→離心得上清液→sevag法除蛋白→70%乙醇沉淀→沉淀冷凍干燥→硫酸軟骨素粗品。

1.2.3酶解工藝條件的確定。對復合酶的比例和pH進行優化。取3份各10g鰹魚骨樣品，按2.0%的比例添加木瓜蛋白酶，按1∶30(M/V)的料液比加入蒸餾水，分別調節pH為5.0、6.0、7.0，于50 ℃浸提24h，超聲輔助處理30 min，測得提取液CS總含量分別為90.7、123.9、185.4 mg。另取3份樣品，采用胰蛋白酶提取，調節pH為5.0、6.0、7.0，測得提取液CS總含量分別為88.5、164.6、116.7 mg。

1.2.4提取率影響因素的確定。①料液比。取鰹魚骨10 g，酶添加量2.0%(木瓜蛋白酶∶胰蛋白酶為1∶2)，提取溫度50 ℃，pH 6.5下浸提24 h，超聲輔助處理30 min，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，過濾后測定液體中硫酸軟骨素的總含量。②提取溫度。取鰹魚骨10 g，酶添加量2.0%(木瓜蛋白酶∶胰蛋白酶為1∶2)，按1∶30的料液比加入蒸餾水，pH 6.5下浸提24 h，超聲輔助處理30 min，提取溫度分別為40、50、60、70、80 ℃，過濾后測定液體中硫酸軟骨素的總含量。③提取時間。取鰹魚骨10 g，酶添加量2.0%(木瓜蛋白酶∶胰蛋白酶為1∶2)，按1∶30的料液比加入蒸餾水，提取溫度50 ℃，pH 6.5下浸提24 h，超聲輔助提取時間分別為10、20、30、40 min，過濾后測定液體中硫酸軟骨素的總含量。④酶添加量。取鰹魚骨10 g，按1∶30的料液比加入蒸餾水，提取溫度50 ℃，pH 6.5下浸提24 h，超聲輔助處理30 min，酶添加量分別為1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%(木瓜蛋白酶∶胰蛋白酶為1∶2)，過濾后測定液體中硫酸軟骨素的總含量。1.3測定項目與方法①氨基己糖含量。采用衛生部頒布藥品標準規定的方法[19]，并對關鍵的兩步：乙酰化和顯色操作分別進行改進[20]，做到冰浴乙酰化同時計時，顯色隨加隨計時。氨基己糖含量×2.82即為CS的含量。②葡萄糖醛酸含量。按照文獻[21]方法進行測定。③氮含量。按照微量凱氏定氮法進行測定。④水分含量。按照常壓干燥法進行測定。⑤紅外光譜分析。在400～4000 cm-1波數范圍內掃描，KBr壓片測定。

2　結果與分析

2.1酶解工藝條件的確定由圖1可知，木瓜蛋白酶在pH 7.0下提取效果最好，而胰蛋白酶在pH 6.0時提取率最高。在此單因素試驗的基礎上，進一步比較復合酶比例(木瓜蛋白酶∶胰蛋白酶=1∶2、1∶1、2∶1)和pH(6.0、6.5、7.0)對鰹魚骨CS提取效果的影響。結果顯示，復合酶比例1∶2、pH為6.5時CS總含量最高，達205.1 mg。

圖1　復合酶比例和pH對硫酸軟骨素提取率的影響Fig.1　Effects of compound enzyme ratio and pH on the extraction rate of the chondroitin sulfate

2.2硫酸軟骨素提取率影響因素的優化

2.2.1料液比。由圖2可知，鰹魚骨中硫酸軟骨素的提取量隨料液比的增大變化較為明顯，當料液比從1∶10提高到1∶20時，CS含量增加，但當料液比大于1∶20時，CS含量逐漸降低。因此，選擇料液比1∶20左右較為合適。

圖2　料液比、溫度、時間和酶添加量對硫酸軟骨素提取率的影響Fig. 2　Effects of solid-liquid ratio,temperature,time and enzyme adding amount on the extraction rate of the chondroitin sulfate

2.2.2提取溫度。由圖2可知，隨著提取溫度的升高，硫酸軟骨素的提取量不斷增加，當提取溫度為70 ℃時CS含量達到最大，而后下降。研究表明，蛋白酶的最適溫度并非保證最好的提取效果，一定的高溫反而有利于CS從魚骨組織中溶出。考慮到90 ℃以上的高溫可能對多糖的結構和活性有一定的影響，因此，選擇60～80 ℃作為提取的最適溫度。

2.2.3提取時間。由圖2可知，隨著提取時間的增加，硫酸軟骨素的提取量相應增加；當超聲提取時間由10 min延長至30 min，CS提取率增加趨勢明顯；當超聲提取時間為40 min時，CS含量有所下降。因此，選擇超聲輔助提取時間30 min左右為宜。

2.2.4酶添加量。由圖2可知，酶添加量在2.5%時硫酸軟骨素的提取量最高。隨著酶添加量的增加，CS含量變化趨勢平緩，可見酶添加量對CS的提取影響并不顯著。

2.3正交試驗結果根據單因素試驗結果，選擇料液比、提取溫度、超聲時間3個對硫酸軟骨素提取率影響顯著的因素，以CS提取率為指標，按L9(33)進行正交試驗設計，各因素水平見表1。

表1　正交試驗因素水平

由表2可知，超聲輔助提取硫酸軟骨素的過程中，提取溫度對硫酸軟骨素的提取率影響最大，其次是超聲時間，料液比的影響最小。最佳組合為A2B3C2，即在酶添加量2.5%(木瓜蛋白酶∶胰蛋白酶為1∶2)、料液比1∶20、提取溫度80 ℃、pH 6.5下浸提24 h、超聲處理30 min的最佳工藝條件下，硫酸軟骨素的提取率最高。在此最佳工藝條件下進行驗證試驗，可從鰹魚骨中提取到28.60 mg/g硫酸軟骨素，提取率達2.86%。

2.4理化性質分析取100 g鰹魚骨按照優化的工藝提取硫酸軟骨素，測定所得CS的各項指標，其結果見表3。由表3可知，鰹魚骨硫酸軟骨素各項指標均符合衛生部頒布藥品標準規定的硫酸軟骨素指標[19]。

表2硫酸軟骨素提取正交試驗結果

Table 2Results of orthogonal test for the extraction of chondroitin sulfate

試驗號TestNo.因素FactorABC提取率Extractionrate∥%11111.6121222.0831332.1642122.1252232.3062312.1373131.9783211.9293322.53k11.951.901.89k22.182.102.24k32.142.272.14R0.230.370.36

表3　硫酸軟骨素的理化性質

圖3　硫酸軟骨素提取率的紅外光譜Fig.3　 Infrared spectrum of the extraction rate of chondroitin sulfate

2.5紅外吸收光譜由圖3可知，紅外光譜在3 430 cm-1附近有一寬的強吸收峰，為糖環上羥基(-OH)的伸縮振動引起；在2 925 cm-1附近有糖分子中甲基(-CH3)伸縮振動的特征峰；在1 631 cm-1附近有乙酰氨基(-NHCOCH3-)伸縮振動的特征峰；在1 414 cm-1附近有羧基(-COO-)的C=O伸縮振動；在1 236 cm-1附近有硫酸基(-O-SO3-)的S=O伸縮振動；在1 069 cm-1附近有糖環醚(C-O-C)伸縮振動的特征峰；在926 cm-1附近有吡喃環非對稱環伸縮振動的特征峰。表明樣品中含有硫酸軟骨素所有羥基、甲基、乙酰氨基、羧基、硫酸基和糖環等官能團，以上紅外光譜特征與其他研究結果[17,22]一致，表明鰹魚骨硫酸軟骨素為硫酸軟骨素C。

3　結論

該研究通過系列優化試驗建立了鰹魚骨中硫酸軟骨素的提取工藝，為有效利用鰹魚加工副產物提供了新思路。樣品采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶復合酶解，80 ℃水浸提24 h并輔以超聲提取， sevag法除蛋白，最后用70%乙醇沉淀獲得鰹魚骨硫酸軟骨素。該方法硫酸軟骨素提取率達2.86%，純度為90.0%，產品為白色粉末，水分含量9.2%，氨基己糖含量30.1%，氮含量3.05%，葡萄糖醛酸含量26.9%。紅外光譜特征顯示其為硫酸軟骨素C。

[1] 李燕妮.不同降解方法制備低分子量硫酸軟骨素的比較[J].化學與生物工程,2014,31(3)∶63-65.

[2] KELLY G S.The role of glucosamine sulfate and chondroitin sulfates in the treatment of degenerative joint disease[J].Altern Med Rev,1998,3(1)：27-39.

[3] CHOU M M,VERGNOLLE N,MCDOUGALL J J,et al.Effects of chondroitin and glucosamine sulfate in a dietary bar formulation on inflammation,interleukin-1beta,matrix metalloprotease-9,and cartilage damage in arthritis[J].Exp Biol Med (Maywood),2005,230(4)：255-262.

[4] 陳磊,凌沛學,賀艷麗,等.硫酸軟骨素和玻璃酸鈉聯合應用治療木瓜酶致兔膝骨關節炎[J].中國生化藥物雜志,2009,30(1)：33-35.

[5] 林進國,劉甘泉.鯊魚軟骨酸性粘多糖對大鼠高血脂影響的研究[J].中國臨床醫藥研究雜志,2007(1)：3-4.

[6] BERGEFALL K，TRYBALA E,JOHANSSON M,et al.Chondroitin sulfate characterized by the E-disaccharide unit is a potent inhibitor of herpes simplex virus infectivity and provides the virus binding sites on gro2C cells[J].J Biol Chem,2005,280(37)：32193-32199.

[7] MOURAO P A,BOISSON-VIDAL C，TAPON-BRETAUDIRE J,et al.Inactivation of thrombin by a fucosylated chondroitin sulfate from echinoderm[J].Thromb Res,2001,102(2)：167-176.

[8] MAKSIMENKO A V,GOLUBYKH V L，TISCHENKO E G.Catalase and chondroitin sulfate derivatives against thrombotic effect induced by reactive oxygen species in a rat artery[J].Metab Eng,2003,5(3)：177-182.

[9] 林洪,姬勝利.硫酸軟骨素的藥理作用及應用研究進展[J].食品與藥品,2006,8(12A)： 4-7.

[10] 李東霞,李德良,張雙全.鯊魚軟骨多糖的理化性質及其與DNA分子相互作用的研究[J].海洋科學,2000,24(5)：40-43.

[11] 劉克為,遲·依荷巴麗,呂靜.鯊魚軟骨素聯合化療治療晚期非小細胞肺癌療效觀察[J].中國腫瘤臨床與康復,2009,16(2)：167-169.

[12] GOLDBERG S H，VON FELDT J M，LORMER J H.Pharmacologic therapy for osteoarthritis[J].Am J Orthop,2002,31(12)：673-680.

[13] 馬淑濤,張天民.硫酸軟骨素生產工藝探討[J].中國醫藥工業雜志,1993(18)：348.

[14] 劉坤,劉颯.孔鰩硫酸軟骨素的制備[J].中國海洋藥物雜志,2004,99(3)：19-22.

[15] 陳小娥,方旭波,余輝,等.魷魚軟骨中硫酸軟骨素的提取工藝研究[J].食品科技,2008,33(12)：214-217.

[16] 鄭江,關瑞章,黃世玉.鱘魚和鯊魚硫酸軟骨素紅外光譜特性的比較研究[J].光譜學與光譜分析，2008(1)：106-109.

[17] 張小軍,張虹.鮟鱇魚硫酸軟骨素的提取及性質研究[J].食品工業科技,2010(12)：258-260.

[18] VIZCARRA-M，AGANA L A，AVILA E，SOTELO A.Silage preparation from tuna fish waste and its nutritional evaluation in broilers[J].J Sci Food Agric,1999,79：1915-1922.

[19] 國藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準：二部第六冊(生化藥品第一分冊)[S].北京：化學工業出版社,1998：138-139.

[20] 齊敬總,閏曉玲,王鳳山.硫酸軟骨素含量測定方法介紹[J].中國生化藥物雜志,2002,23(3)：162.

[21] 凌沛學.透明質酸[M].北京：中國輕工業出版社,2000：41.

[22] MATHEWS M B，WISNER L A，IWAYAMA Y,et al.Isomeric chondroitin sulfate[J].Nature,1958,181：421.

Extraction Technology of Chondroitin Sulfate fromKatsuwonuspelamisBones

CHEN Si,ZHANG Xiao-jun*,YAN Zhong-yong et al

(Key Laboratory of Marine Aquaculture,Zhejiang Institute of Marine Fisheries,Zhoushan,Zhejiang 316100)

[Objective] To research the extraction methods for chondroitin sulfate (CS) withKatsuwonuspelamisbones as the raw materials. [Method] With the extraction rate of chondroitin sulfate as the evaluation index,the extraction condition for chondroitin sulfate was optimized by single factor test and orthogonal test. [Result] Under the conditions of 2.5% enzyme supplementation (papaini∶trypsin=1∶2),1∶20 solid-liquid ratio,80 ℃ extraction temperature,pH 6.5,extraction for 24 h,and ultrasonic treatment for 30 min,the extraction rate of chondroitin sulfate reached 2.86% and the purity was 90.0%. Physical and chemical analysis showed that chondroitin sulfate was white,containing 9.2% moisture,30.1% hexosamine,3.05% nitrogen,and 26.9% glucuronic acid. Infrared spectroscopic analysis showed that the sample was chondroitin sulfate C. [Conclusion] It is feasible to extract chondroitin sulfate fromKatsuwonuspelamisbones by the optimized method,showing some potential for value-add utilization inKatsuwonuspelamisprocessing wastes.

Katsuwonuspelamisbones; Chondroitin sulfate; Extraction; Enzymolysis; Ultrasound

浙江省公益技術研究項目(2014C32087)。

陳思(1984- )，女，浙江杭州人，工程師，博士，從事水產品加工及質量安全方面的研究。*通訊作者，高級工程師，博士，從事水產品加工及質量安全方面的研究。

2016-07-06

S 986

A

0517-6611(2016)24-069-03