煙嘧磺隆人工抗原的合成與鼠源多克隆抗體的制備

李瀟瀟，尤會會，郭　晴，杜俊婷，丁書茂，楊　旭，袁均林

(華中師范大學生命科學學院 遺傳調控與整合生物學湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430079)

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煙嘧磺隆人工抗原的合成與鼠源多克隆抗體的制備

李瀟瀟，尤會會，郭晴，杜俊婷，丁書茂，楊旭，袁均林

(華中師范大學生命科學學院 遺傳調控與整合生物學湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430079)

為了制備煙嘧磺隆的多克隆抗體、建立煙嘧磺隆殘留的免疫分析方法，以2-氨基磺酰基-N,N-二甲基煙酰胺(ASDM)和琥珀酸酐為原料合成半抗原，采用活潑酯法制備人工抗原并免疫小鼠。結果表明：經紫外可見吸收光譜掃描和聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定，人工抗原合成成功，半抗原與卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)的偶聯比分別為10.5∶1和26.9∶1。5次免疫后小鼠抗血清的效價均達到1∶16 000以上，以ASDM-BSA為免疫原的小鼠產生了抑制煙嘧磺隆的多克隆抗體，建立的間接競爭ELISA方法對煙嘧磺隆的檢測范圍是1 ng·mL-1～10 μg·mL-1。為進一步建立更為高效、靈敏和方便的煙嘧磺隆ELISA檢測方法提供了參考。

煙嘧磺隆；人工抗原；多克隆抗體；ELISA

農藥的使用促進了現代農業(yè)的快速發(fā)展。磺酰脲類除草劑因具有高效、低毒和性價比高等特點，應用非常廣泛[1]。煙嘧磺隆(nicosulfuron)，又名玉農樂，是1987～1988年由日本石原產業(yè)公司與美國杜邦公司聯合開發(fā)的一類磺酰脲類除草劑，可有效去除玉米田中多種禾本科雜草以及闊葉雜草，作用原理是通過抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的合成，導致雜草體內纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸合成受阻，最終雜草因細胞分裂受阻，生長停滯而枯死[2]。研究表明，土壤對煙嘧磺隆的吸附性較弱，使其流動性較高，很容易污染地下水[3-4]，且生產此類除草劑的農藥廠所排放的廢水中也含有較高濃度的煙嘧磺隆[5]，對環(huán)境造成嚴重污染。因此，煙嘧磺隆殘留的問題逐漸引起人們的關注。

目前，煙嘧磺隆的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)和液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)等，但這些方法都需要使用大型儀器，樣品的制備及分離耗時耗力，費用昂貴。酶聯免疫吸附測定(ELISA)法因具有方便、靈敏和快速的優(yōu)點可以彌補上述方法的不足，被廣泛地應用于臨床試驗與化學物質分析中[6]。作者通過合成煙嘧磺隆人工抗原，成功制備出煙嘧磺隆多克隆抗體，旨在為建立煙嘧磺隆的ELISA方法提供參考。

1　實驗

1.1材料、試劑與儀器

雌性BALB/c小鼠，6周齡，湖北省實驗動物研究中心。

煙嘧磺隆(純度為95%)、丁二酸酐，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠抗體IgG，Jackson公司；卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)、弗氏完全佐劑(FCA)和弗氏不完全佐劑(FIA)，Sigma公司；2-氨基磺酰基-N,N-二甲基煙酰胺(ASDM，純度98%)，北京百靈威公司；二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，成都西亞試劑公司；低分子量Marker，北京天根生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

Eppendorf5415R型低溫冷凍離心機，Beckman公司；UV-2700型紫外可見分光光度計，Shimadzu公司；DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京六一儀器廠；酶標分析儀，北京普朗新公司。

1.2方法

1.2.1人工抗原的合成

煙嘧磺隆分子結構中不含活潑基團，結構比較穩(wěn)定，采用煙嘧磺隆分子一半結構的化合物ASDM來合成人工抗原，合成路線如圖1所示：

圖1煙嘧磺隆人工抗原的合成路線

Fig.1Synthetic route of nicosulfuron artificial antigen

參照文獻[7]合成人工抗原ASDM-OVA，并做適當的改進。將46 mg ASDM與20 mg琥珀酸酐溶于3 mL二甲基甲酰胺(DMF)中攪拌過夜，加入23 mg NHS和41.23 mg DCC，繼續(xù)攪拌12 h。稱取50 mg OVA 用10 mL 0.2 mol·L-1pH 值9.0硼酸鹽緩沖液溶解，將上述反應液逐滴加入到蛋白溶液中，繼續(xù)攪拌反應12 h，3 000 r·min-1離心5 min。將上清液放入透析袋中，于4 ℃PBS緩沖液中透析72 h，期間每隔12 h更換一次PBS緩沖液，收集透析袋內液體，得到人工抗原ASDM-OVA。

將OVA更換為BSA，同法合成人工抗原ASDM-BSA。

1.2.2人工抗原的鑒定

1.2.2.1紫外可見吸收光譜掃描

用PBS緩沖液調零，將ASDM稀釋至一定倍數時即可進行紫外可見吸收光譜掃描獲得清晰的光譜，然后將BSA、OVA和兩種人工抗原均稀釋至1 mg·mL-1進行紫外可見吸收光譜掃描。

1.2.2.2SDS-PAGE鑒定

配制10%的分離膠和4%的濃縮膠，電泳完畢后用考馬斯亮藍R-250染色45 min，用脫色液洗脫至膠的背景接近透明時，凝膠成相。

1.2.3小鼠的免疫及煙嘧磺隆多克隆抗體的制備

將6只雌性BLAB/c小鼠隨機分成2組：ASDM-OVA免疫組和ASDM-BSA免疫組。初次免疫將人工抗原與FCA等體積混合并充分乳化，免疫用量為每只100 μg。4周后進行第二次免疫，用等體積FIA乳化，免疫用量為每只50 μg，以后每隔2周按第二次免疫方法重復免疫一次，第5次免疫結束后的第7 d，將小鼠斷尾取血，收集血清。用間接ELISA方法檢測其效價，用間接競爭ELISA方法對其靈敏度進行檢測[8]。

2　結果與討論

2.1紫外可見吸收光譜(圖2)

圖2 紫外可見吸收光譜

由圖2可知，ASDM、載體蛋白和人工抗原的紫外可見吸收光譜不同。ASDM的最大吸收峰在264.3 nm處；OVA、ASDM-OVA的最大吸收峰分別在279.0 nm、277.8 nm處;而BSA、ASDM-BSA的最大吸收峰分別在278.0 nm、276.8 nm處。兩種人工抗原與載體蛋白相比波峰均有所偏差，證實ASDM與載體蛋白偶聯成功。

2.2人工抗原的SDS-PAGE圖譜(圖3)

圖3　人工抗原的SDS-PAGE圖譜

從圖3可以看出，第3和第5泳道的人工抗原與第2和第4 泳道相應的載體蛋白相比明顯滯后，表明ASDM與載體蛋白偶聯成功。

根據標準蛋白Marker的遷移距離得到蛋白相對分子質量對數值與電泳相對遷移率的標準曲線，見圖4。

圖4　蛋白相對分子質量對數值與電泳相對遷移率標準曲線

由圖4的標準曲線計算人工抗原ASDM-OVA的相對分子質量為48 450.69，人工抗原ASDM-BSA的相對分子質量為74 851.41，而兩種載體蛋白OVA、BSA的相對分子質量分別為45 kDa和66 kDa，計算可得ASDM與OVA和BSA的偶聯比分別為10.5∶1和26.9∶1。

2.3抗血清的效價及靈敏度的檢測

以其中一種人工抗原為免疫原時則用另一種人工抗原作為包被抗原，以0.5 μg·mL-1的濃度包被時測得第5次免疫后小鼠血清OD值如表1所示。以OD值約為1時的血清稀釋倍數作為小鼠抗血清的效價(即中點效價)。

表1小鼠抗血清效價

Tab.1　Titer of mice antiserum

由表1可知，ASDM-OVA免疫組3只小鼠抗血清效價分別為1∶32 000、1∶64 000和1∶128 000；ASDM-BSA免疫組小鼠抗血清效價分別為1∶32 000、1∶32 000和1∶16 000，可見所有免疫的小鼠均產生較高效價的抗體。確定所有小鼠的效價后，設置濃度梯度為10 μg·mL-1、1 μg·mL-1、10-1μg·mL-1、10-2μg·mL-1、10-3μg·mL-1和10-4μg·mL-1的煙嘧磺隆溶液對每只小鼠的抗血清進行靈敏度檢測。結果發(fā)現，雖然ASDM-OVA作為免疫原產生了高效價的抗體，但其抑制效果不明顯，檢測不到靈敏度；而以ASDM-BSA作為免疫原的2號和3號小鼠的抗血清能對煙嘧磺隆產生抑制，且3號小鼠的抑制效果最好，進一步證實兩種人工抗原合成成功，也表明成功制備出煙嘧磺隆的多克隆抗體。

采用1 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、0.25 μg·mL-1、0.125 μg·mL-1的包被濃度對3號小鼠的抗血清進行靈敏度檢測，發(fā)現不同的包被濃度對抑制率并沒有太大的改變，而且較低濃度的包被抗原會降低抗原的最大抑制率的檢測濃度，即檢測上限。本研究發(fā)現以0.5 μg·mL-1的包被濃度檢測靈敏度時得出的標準曲線線性關系最好。3號小鼠的抗血清對煙嘧磺隆的標準抑制曲線如圖5所示。

由圖5可知，在1 ng·mL-1～10 μg·mL-1范圍內抑制率與煙嘧磺隆濃度對數值呈良好的線性關系，線性回歸方程為y=0.0768lgc+0.2979，R2=0.9954。

2.4討論

農藥等小分子物質不具有免疫原性，必須通過與蛋白質等大分子物質偶聯才有可能使機體產生相應的抗體，因此，合成人工抗原是多克隆抗體制備的關鍵步驟。為了使小分子物質連接到載體蛋白上時能夠充分

圖5　煙嘧磺隆標準抑制曲線

暴露其抗原決定簇，需要用一定長度的“連接臂”使半抗原與載體蛋白偶聯。磺酰脲類除草劑的分子結構特點是中間含有一個磺酰脲橋結構，兩端連接芳環(huán)和雜環(huán)。Zhao等[9]以戊二醛作交聯劑，將芐嘧磺隆分子與載體蛋白偶聯，成功制備出兩種人工抗原，最終用制備的單克隆抗體建立了芐嘧磺隆的間接競爭ELISA檢測方法。煙嘧磺隆的分子結構與芐嘧磺隆類似，其脲橋兩端分別連接兩個不同結構的雜環(huán)，由于兩側基團電荷分布不均勻，理論上脲結構中兩個亞氨基上的氫可以被取代。

在對磺酰脲類除草劑人工抗原合成方法的探索中，研究人員采用農藥分子一半的結構與琥珀酸酐反應合成半抗原，使其連上一個含有4個C原子的羧基，再采用活潑酯法進行人工抗原的合成，最終成功制備出芐嘧磺隆、甲磺隆和氯嘧磺隆的抗體[10-12]。本研究也采取活潑酯法合成煙嘧磺隆人工抗原，ASDM不僅是煙嘧磺隆分子結構的一半，而且其結構上含有一個活潑氨基，可與琥珀酸酐反應生成半抗原。在半抗原合成過程中往往要對生成的產物進行萃取、蒸餾、重結晶和質譜鑒定等一系列復雜的操作，而本研究選用DMF作溶劑，將加入的ASDM和琥珀酸酐長時間攪拌后直接加到蛋白溶液中合成人工抗原，省去了上述復雜的操作流程。人工抗原經SDS-PAGE和紫外可見吸收光譜檢測，結果表明偶聯成功。小鼠經免疫后獲得了對煙嘧磺隆產生抑制的抗血清，不僅證明人工抗原的合成成功，而且表明對此種方法的改進是可行的。

以ASDM-OVA作為免疫原的小鼠抗血清效價均達到1∶32 000以上，而以ASDM-BSA作為免疫原的小鼠最高效價才達到1∶32 000，從產生抗體效價的角度來看，以OVA為載體蛋白的免疫效果更好。小鼠抗血清產生較高的效價說明產生的抗體與包被抗原具有良好的結合能力，通過檢測并計算抑制率可判定抗體能否被小分子識別，從而最終證明所需要的目標抗體是否產生。本研究結果表明，以ASDM-BSA為免疫原的小鼠產生了能夠識別煙嘧磺隆的多克隆抗體，所以在人工抗原合成后都要作為免疫原進行測試，研究其免疫效果；并且免疫的動物數量要盡可能多一些，從而避免動物的個體差異對實驗結果造成影響。

所合成抗體對煙嘧磺隆的最高抑制率只有38%，可能的原因是ASDM連接到蛋白上作為抗原決定簇使被免疫的小鼠不僅產生能與煙嘧磺隆結合的抗體，而且還產生了ASDM與連接臂相結合，或者連接到載體上的其它小分子的抗體，從而使多克隆抗體中非目標抗體的含量增加。該多抗建立的間接競爭ELISA檢測方法對煙嘧磺隆具有良好的檢測效果，檢測范圍為1 ng·mL-1～10 μg·mL-1，其最低檢測限為1 ng·mL-1，低于UPLC-MS/MS方法的最低檢測殘留量0.01 mg·L-1[13]。

3　結論

以煙嘧磺隆分子結構的一半的物質ASDM和琥珀酸酐為原料，以DMF為反應溶劑直接合成半抗原，反應產物不需要復雜的提純與鑒定程序就可以直接與載體蛋白進行偶聯。免疫小鼠后獲得高效價并具有靈敏度的抗血清，證實該方法合成人工抗原的可行性，不僅為煙嘧磺隆多克隆抗體的制備與ELISA檢測方法的建立提供條件，也為合成含有氨基基團的小分子的人工抗原提供了更便捷的技術。

[1]張敏恒.磺酰脲類除草劑的發(fā)展現狀、 市場與未來趨勢[J].農藥，

2010，49(4):235-240.

[2]KARPOUZAS D G，PAPADOPOULOU E，IPSILANTIS I，et al.Effects of nicosulfuron on the abundance and diversity of arbuscular mycorrhizal fungi used as indicators of pesticide soil microbial toxicity[J].Ecological Indicators，2014，39(4):44-53.

[3]張偉，王進軍，張忠明，等.煙嘧磺隆在土壤中的吸附及與土壤性質的相關性研究[J].農藥學學報，2006，8(3):265-271.

[4]REGITANO J B，KOSKINEN W C.Characterization of nicosulfuron availability in aged soils[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56(14):5801-5805.

[5]KANG Z H，DONG J G，ZHANG J L.Optimization and characterization of nicosulfuron-degrading enzyme fromBacillussubtilisstrain YB1[J].Journal of Integrative Agriculture，2012，11(9):1485-1492.

[6]QIAN G，WANG L，WU Y，et al.A monoclonal antibody-based sensitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the analysis of the organophosphorous pesticides chlorpyrifos-methyl in real samples[J].Food Chemistry，2009，117(2):364-370.

[7]ZHAO J，LI G，YI G X，et al.Comparison between conventional indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (icELISA) and simplified icELISA for small molecules[J].Analytica Chimica Acta，2006，571(1):79-85.

[8]LIU W，ZHAO C，ZHANG Y，et al.Preparation of polyclonal antibodies to a derivative of 1-aminohydantoin (AHD) and development of an indirect competitive ELISA for the detection of nitrofurantoin residue in water[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55(17):6829-6834.

[9]ZHAO J，YU X，LUO Q，et al.Anti-bensulfuron methyl monoclonal antibody production and BSM-detecting indirect competitive enzyme-linked immunoassay establishment[J].Food and Agricultural Immunology，2014，25(3):350-363.

[10]LEE J K，AHN K C，PARK O S，et al.Development of an immunoassay for the residues of the herbicide bensulfuron-methyl[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50(7):1791-1803.

[11]DEGELMANN P，WENGER J，NIESSNER R，et al.Development of a class-specific ELISA for sulfonylurea herbicides (sulfuron screen)[J].Environmental Science & Technology，2004，38(24):6795-6802.

[12]ZHAO J，YI G X，HE S P，et al.Development of a monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for the herbicide chlorimuron-ethyl[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry，2006，54(14):4948-4953.

[13]陳國峰，孫悅萍，劉峰，等.超高效液相色譜-串聯質譜法測定環(huán)境樣品中煙嘧磺隆殘留量[J].農藥科學與管理，2015，36(11):43-45.

Synthesis of Nicosulfuron Artificial Antigen and Preparation of Mouse Polyclonal Antibody

LI Xiao-xiao，YOU Hui-hui，GUO Qing，DU Jun-ting，DING Shu-mao，YANG Xu，YUAN Jun-lin

(HubeiKeyLaboratoryofGeneticRegulationandIntegrativeBiology，CollegeofLifeScience，CentralChinaNormalUniversity，Wuhan430079，China)

Topreparethepolyclonalantibodiesagainstpesticidenicosulfuronandestablishanimmunochemicalassaytodetectnicosulfuronresidue，haptensweresynthesizedwith2-aminosulfonyl-N，N-dimethylnicotinamide(ASDM)andsuccinicanhydrideasrawmaterials.Artificialantigensweresynthesizedbyconnectingthehaptentocarrierproteinswithanactiveestermethod，andthenmicewereimmunized.ThetwoartificialantigenswerepreparedsuccessfullyandidentifiedbyUV-visiblespectroscopyandSDS-PAGE.Thecouplingratioswere10.5∶1and26.9∶1forASDMtoovalbumin(OVA)andbovineserumalbumin(BSA)，respectively.Afterquinticanimalimmunizations，theantibodytiterofallimmunizedmicewereover1∶16 000，wherebypolyclonalantibodiesagainstnicosulfuronwereacquiredfrommiceimmunizedbyASDM-BSA.AndthenanindirectcompetitiveELISAwasestablishedfornicosulfuroncontentdeterminationwithadetectionrangeof1ng·mL-1～10μg·mL-1.Thisresearchcouldprovidereferenceforfurtherdevelopmentofmoresensitive，effectiveandfeasibleELISAdetectionmethod.

nicosulfuron；artificialantigen；polyclonalantibody；ELISA

國家自然科學基金資助項目(21577045)

2016-03-24

李瀟瀟(1993-)，男，安徽亳州人，碩士研究生，研究方向：生物化學，E-mail：lixiaoxiao201409@sina.com；通訊作者：袁均林，副教授，E-mail:yuanjl@mail.ccnu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.09.007

TQ 450S 859.84

A

1672-5425(2016)09-0027-05

李瀟瀟，尤會會，郭晴，等.煙嘧磺隆人工抗原的合成與鼠源多克隆抗體的制備[J].化學與生物工程，2016，33(9)：27-31.