黑曲霉產胺氧化酶培養及誘導條件的優化

周小虎，朱霞，王磊，焦夢然，黃瑤，付彩霞，曹約澤，高冰，汪超，李冬生，徐寧*

（1.湖北工業大學工業發酵湖北省協同創新中心湖北省食品發酵工程技術研究中心，湖北武漢430068；2.湖北土老憨調味食品股份有限公司湖北省發酵調味品工程技術研究中心，湖北宜昌443000；3.湖北順溪生物食品股份有限公司，湖北十堰442300）

黑曲霉產胺氧化酶培養及誘導條件的優化

周小虎1，朱霞1，王磊1，焦夢然1，黃瑤1，付彩霞2，曹約澤3，高冰1，汪超1，李冬生1，徐寧1*

（1.湖北工業大學工業發酵湖北省協同創新中心湖北省食品發酵工程技術研究中心，湖北武漢430068；2.湖北土老憨調味食品股份有限公司湖北省發酵調味品工程技術研究中心，湖北宜昌443000；3.湖北順溪生物食品股份有限公司，湖北十堰442300）

黑曲霉可經誘導產生胺氧化酶，該酶具有催化生物胺氧化脫氨生成相應醛、氨氣和過氧化氫的特性。黑曲霉胺氧化酶產生分菌體生長和誘導產酶兩個階段。通過單因素試驗優化得出黑曲霉產胺氧化酶的菌體生長最佳培養條件：氮源為NaNO3，碳源為麥芽糖，接種量1%，培養時間24 h；誘導產酶的最佳培養條件：誘導氮源為質量濃度60 g/L的正己胺，誘導碳源為葡萄糖，培養時間36 h，培養溫度30℃，搖床轉速160 r/min，初始pH 7.0，胺氧化酶酶活力從誘導前的1 006.5 U/g提升至1 422.4U/g，提高幅度為41.3%。

黑曲霉；胺氧化酶；生物胺；條件優化

生物胺是一類具有生物活性含氮的低分子質量有機化合物的總稱，是生成激素、核酸、生物堿、蛋白質等物質的前體，具有維持免疫系統代謝活性和正常的內臟功能的作用［1］。人體內適量的生物胺能調節各種正常的生理作用，但當存在過量生物胺時，就會改變正常生理機能，從而產生毒性作用［2］。發酵食品中生物胺的主要來源是某些細菌產生的氨基酸脫羧酶催化氨基酸發生了脫羧反應而形成［3-4］。胺氧化酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，催化各種小分子胺類物質氧化脫氨基形成相應的醛、過氧化氫和氨［5-7］。微生物中黑曲霉產胺氧化酶研究最早，當其在以正丁胺作為唯一氮源的培養基中誘導可獲得三種胺氧化酶，分別為MAO-N、AO-Ⅰ、AO-Ⅱ，前者為含黃素單胺氧化酶（EC 1.4.3.4），可催化一級胺、一些二級和三級胺氧化；后兩種為含銅胺氧化酶（EC 1.4.3.6），具有氧化一級單胺活性和二元胺的特性［8-10］。

因此胺氧化酶可以催化分解生物胺，在發酵食品中使用可降低生物胺的含量，保證食品安全［11-12］。黑曲霉工業應用廣泛，也是安全的食品發酵菌種［13］，本研究以一株從黑曲霉3.350分離出的FF05菌株為出發菌，研究了其產生胺氧化酶的培養及誘導條件，為該酶的應用提供了理論支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

黑曲霉（Aspergillus niger）FF05：湖北省食品發酵工程技術研究中心保藏；辣根過氧化物酶（300 U/mg）、愈創木酚：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

種子培養基：豆汁1 000 mL，可溶性淀粉20 g，MgSO40.5 g，KH2PO41.0 g，（NH4）2SO40.5 g，pH7.0，121℃滅菌20 min。

發酵培養基：蔗糖30 g，（NH4）2SO42.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，酵母抽提物1g，蒸餾水1000mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

誘導培養基：蔗糖50g，正丁胺5g，K2HPO41.0g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.2儀器與設備

LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；ZAD-1270生化培養箱：上海智城分析儀器制造公司；WFJ2000紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1黑曲霉培養

從黑曲霉斜面接種1～2環孢子到種子培養基（裝液量50 mL/250 mL），30℃、180 r/min培養36 h。菌體生長培養條件：取體積分數1%種子液接種至發酵培養基，180 r/min培養36 h。誘導產酶培養條件：取體積分數1%發酵液接種至誘導培養基，30℃、180 r/min培養24 h。

1.3.2產胺氧化酶條件的優化

（1）菌體生長條件的優化

以發酵培養基為基礎，分別采用2.0g的尿素、（NH4）2SO4、NH4NO3和NaNO3代替發酵培養基中的氮源，其他成分不變，考察氮源對產胺氧化酶酶活力的影響；

以發酵培養基為基礎，分別采用30 g的葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉和甘露醇代替發酵培養基中的碳源，其他成分不變，考察碳源對產胺氧化酶酶活力的影響；

以菌體生長培養條件為基礎，改變培養時間分別為12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h，其他條件不變，考察培養時間對產胺氧化酶酶活力的影響；

以菌體生長培養條件為基礎，在發酵培養基中分別接種0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的種子液，其他條件不變，考察接種量對產胺氧化酶酶活力的影響。

（2）誘導產酶條件的優化

以誘導培養基為基礎，分別采用5 g/L的丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺和芐胺替代誘導培養基中的氮源，其他成分不變，考察誘導氮源對產胺氧化酶酶活力的影響。

以誘導培養基為基礎，分別調整正己胺質量濃度為0.5 g/L、1 g/L、2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L和10 g/L，其他成分不變，考察正己胺質量濃度對產胺氧化酶酶活力的影響。

以誘導培養基為基礎，分別采用50g/L的葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉和甘露醇替代誘導培養基中的碳源，其他成分不變，考察誘導碳源對產胺氧化酶酶活力的影響。

以誘導培養基為基礎，分別調整誘導培養時間為12 h、 24 h、36 h、48 h、60 h；誘導培養溫度為20℃、23℃、25℃、28℃、30℃、33℃、35℃；搖床轉速為100 r/min、120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min；初始pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5；考察不同誘導條件對產胺氧化酶酶活力的影響。

1.3.3胺氧化酶粗酶提取

將1 g菌絲放入10 mL離心管中，加入5 mL的硫酸鉀緩沖液，放在裝滿冰塊的燒杯中，進行冷凍超聲破碎。設定超聲功率為60%，超聲間隔為2 s，選擇超聲時間為5 min。將超聲破碎獲得的粗酶液，10 000 r/min離心10 min，去沉淀，取上清液，測量酶活。加入pH 7.0的磷酸鉀緩沖液，定容，保存于4℃環境中待用。

1.3.4胺氧化酶酶活力測定

胺氧化酶先作用于胺類生成相應的醛類、H2O2和氨，然后使用辣根過氧化物酶催化釋放的H2O2產生氧氣，使無色的愈創木酚氧化成紅棕色的四鄰甲氧基連酚。該產物在波長470 nm處有最大的光吸收，可通過測定ΔA470nm間接表示胺氧化酶的活力［14-15］。3 mL反應體系包括0.1 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，0.2 mmol/L正丁胺，0.2 mg/mL辣根過氧化物酶，0.05 mol/L愈創木酚，100 μL稀釋酶液。25℃條件下檢測波長470 nm處的吸光度值變化（ΔA470nm/min）。以每分鐘內A470nm變化0.01為1個酶活性單位（U）。相對酶活力以每組實驗中所產酶活力最高為100%。

2　結果與分析

2.1黑曲霉產酶培養條件優化

2.1.1氮源對胺氧化酶酶活力的影響

圖1　氮源對胺氧化酶酶活力的影響Fig.1 Effect of nitrogen sources on amine oxidase production

由圖1可知，NaNO3作為發酵培養基氮源時酶活最高，尿素作為發酵培養基氮源時酶活最低，可能是由于有機氮源尿素相對于無機氮源利用率較低。因此選擇NaNO3為發酵培養基最適氮源。

2.1.2碳源對產胺氧化酶酶活力的影響

由圖2可知，不同碳源對胺氧化酶酶活的影響依次為麥芽糖＞果糖＞葡萄糖＞淀粉＞蔗糖＞甘露醇。因此選擇麥芽糖為發酵培養基最適碳源。

圖2　碳源對胺氧化酶酶活力的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on amine oxidase production

2.1.3培養時間對胺氧化酶酶活力的影響

圖3　培養時間對胺氧化酶酶活力的影響Fig.3 Effect of culture time on amine oxidase production

由圖3可知，隨著發酵時間的增長，誘導后胺氧化酶的酶活呈現先增高再降低的趨勢，培養24h時，酶活達到最高。因此選擇24 h為最適菌體培養時間。

2.1.4接種量對胺氧化酶酶活力的影響

圖4　接種量對胺氧化酶酶活力的影響Fig.4 Effect of inoculum on amine oxidase production

由圖4可知，接種量為0.1%～1.0%時，胺氧化酶酶活較高，接種量＞1.0%后，酶活明顯下降。可能是因為接種量過多，空間、營養不夠，導致菌絲球直徑小，菌種不夠成熟，影響了后面的誘導實驗。因此選擇1.0%為最適接種量。在此優化的培養條件下，胺氧化酶酶活為1 006.5 U/g。

2.2誘導培養條件的優化

2.2.1誘導氮源對胺氧化酶酶活力的影響

圖5　誘導氮源對胺氧化酶酶活力的影響Fig.5 Effect of induction nitrogen sources on amine oxidase production

由圖5可知，不同誘導氮源對胺氧化酶的誘導結果差異性很大，丙胺、芐胺誘導能力很低，相對酶活力＜30%。正己胺的誘導能力最好，正丁胺和正戊胺次之。因此選取正己胺為誘導培養基的氮源。

2.2.2正己胺質量濃度對胺氧化酶酶活力的影響

圖6　正己胺質量濃度對胺氧化酶酶活力的影響Fig.6 Effect of different n-hexylamine concentrations on amine oxidase production

由圖6可知，隨著正己胺含量的逐漸升高，酶產量也逐漸升高，當正己胺質量濃度達到6 g/L時，酶活力達到最高。當正己胺質量濃度＞6 g/L后，酶活力逐漸開始緩慢降低，說明高濃度的誘導劑不利于酶的誘導。因此，后續試驗中選用正己胺質量濃度為6 g/L。

2.2.3誘導碳源對胺氧化酶酶活力的影響

圖7　誘導碳源對胺氧化酶酶活力的影響Fig.7 Effect of different induction carbon sources on amine oxidase production

由圖7可知，6種碳源都有較好的誘導產酶效果，也說明菌絲以完成生長階段，碳源對產酶影響不顯著，其中葡萄糖對黑曲霉產胺氧化酶的效果最好，因此選擇葡萄糖為最佳誘導碳源。

2.2.4誘導培養時間對胺氧化酶酶活力的影響

圖8　誘導培養時間對胺氧化酶酶產量的影響Fig.8 Effect of induction culture time on amine oxidase production

由圖8可知，誘導培養時間為12～36 h時，隨著時間的延長酶活增加；36h時酶活達到最高；36～60 h時，隨著時間的延長，酶活逐漸降低。可能是由于一元胺誘導培養基并不適宜黑曲霉的生長，在誘導前期，黑曲霉菌種還能繼續生長，并為了適應一元胺類培養基，逐漸的分泌胺氧化酶來維持其生長，因此酶產量一直在增高。到了36 h后，黑曲霉由于無法完全利用一元胺生長，導致黑曲霉生長能力大幅度下降，甚至開始出現自溶現象，胺氧化酶也漸漸失活，酶活降低。因此選擇誘導培養時間36 h為宜。

2.2.5誘導培養溫度對胺氧化酶酶活力的影響

圖9　誘導培養溫度對胺氧化酶酶活力的影響Fig.9 Effect of induction culture temperature on amine oxidase production

由圖9可知，隨著誘導培養溫度的升高，酶活呈現先增加后降低的趨勢，培養溫度為30℃時，酶產量最高。可能是因為胺氧化酶的誘導分泌跟黑曲霉的生長情況有密切的關系，在30℃時，黑曲霉的生長代謝最旺盛，分泌的胺氧化酶酶活力也最高。因此選擇誘導培養溫度30℃為宜。

2.2.6搖床轉速對胺氧化酶酶活力的影響

圖10　搖床轉速對胺氧化酶酶活力的影響Fig.10 Effect of shaking speed on amine oxidase production

由圖10可知，隨著搖床轉速的增加，酶活逐漸升高，搖床轉速＞160 r/min后，酶活趨于穩定。說明培養達到一定轉速后，滿足了黑曲霉生長所需的氧氣量。因此選擇搖床轉速160 r/min為宜。

2.2.7誘導初始pH對胺氧化酶酶活力的影響

由圖11可知，初始pH對產酶量的影響較顯著，pH≥7.5或pH≤6.0的時候都不利于胺氧化酶的產生，在初始pH值為7.0的時候是最利于胺氧化酶的產生的，因此選擇初始pH值為7.0的培養基。通過誘導產酶條件的優化，胺氧化酶酶活達到1 422.4 U/g。

圖11　誘導pH對胺氧化酶酶活力的影響Fig.11 Effect of induction pH on amine oxidase production

3　結論

通過單因素實驗優化得出黑曲霉產胺氧化酶的最佳菌體生長培養條件：氮源為NaNO3，碳源為麥芽糖，接種量1.0%，培養時間24 h；誘導產酶培養的最佳條件：誘導氮源為6g/L正己胺，誘導碳源為50 g/L葡萄糖，誘導時間36 h，溫度30℃，搖床轉速160 r/min，pH 7.0。胺氧化酶酶活力從誘導前的1 006.5 U/g提升至1 422.4 U/g，提高幅度為41.3%。

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ZHOU Xiaohu1，ZHU Xia1，WANG Lei1，JIAO Mengran1，HUANG Yao1，FU Caixia2，CAO Yueze3，GAO Bing1，WANG Chao1，LI Dongsheng1，XU Ning1*
（1.Hubei Cooperative Innovation Center for Industrial Fermentation，Research Center of Food Fermentation Engineering and Technology of Hubei，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China；2.Research Center of Fermentation flavouring Engineering and Technology of Hubei，Hubei Tulaohan Flavouring and Food Co.，Ltd.，Yichang 443000，China；3.Hubei Shunxi Biological Food Co.，Ltd.，Shiyan 442300，China）

Amine oxidase can be produce by inducedAspergillus niger，and has the characteristic of catalyzing biogenic amines to their corresponding aldehydes，H2O2and NH3.There are two stages duringA.nigeramine oxidase production，including cell growth and enzyme induction.Single factor experiments were adopted to optimize the liquid fermentation medium and induction conditions for amine oxidase production byA.niger.The optimum fermentation conditions were nitrogen source NaNO3，carbon source maltose，inoculum 1%，culture time 24 h.The optimum induction conditions were induction nitrogen source 60 g/L normal hexyl amine，carbon source glucose，culture time 36 h，temperature 30℃，rotate speed 160 r/min，and initial pH 7.0.The amine oxidase activity increased from 1 006.5 U/g to 1 422.4 U/g after induction，which increased 41.3%.

Aspergillus niger；amine oxidase；biogenic amine；optimizing condition

TS264.2

0254-5071（2016）06-0096-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.020

2016-03-21

國家級大學生創新創業訓練計劃項目（20130500009）；湖北省教育廳項目（Q20141409）

周小虎（1993-），男，本科生，研究方向為食品科學與工程。

徐寧（1979-），男，講師，博士，研究方向為生物工程。