高產輔酶Q10類球紅細菌的化學誘變篩選及其發酵培養基優化

扶教龍，錢大偉，吳晨奇，徐敏強，胡翠英，李良智

（蘇州科技大學化學與生物工程學院，江蘇蘇州215000）

高產輔酶Q10類球紅細菌的化學誘變篩選及其發酵培養基優化

扶教龍，錢大偉*，吳晨奇，徐敏強，胡翠英，李良智

（蘇州科技大學化學與生物工程學院，江蘇蘇州215000）

利用菌株對（維生素K3+疊氮化鈉+對羥基苯甲酸）的復合抗性作為篩選標記，對產輔酶Q10的類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides）使用亞硝基胍進行化學誘變，篩選高產菌株并采用響應面法優化其發酵培養基。結果表明，經誘變選育得到一株遺傳穩定的輔酶Q10高產菌株R.sp3-7，其最佳發酵培養基組成為：葡萄糖31.7 g/L，玉米漿干粉5.6 g/L，（NH4）2SO45.3 g/L、谷氨酸鈉3.0 g/L、NaCl 3.0 g/L、MgSO4·7H2O 12.5 g/L、KH2PO43.0 g/L、CaCO32.0 g/L、輔液1 mL/L。在此培養條件下，誘變菌株R.sp3-7的輔酶Q10產量達（93.63±0.59）mg/L，與出發菌株相比提高了116.8%。

輔酶Q10；抗性平板；化學誘變；響應面分析方法；類球紅細菌

輔酶Q10（coenzyme Q10，CoQ10）廣泛存在于高等動物線粒體內膜中的一種內源性物質，是呼吸鏈的重要遞氫體，是生成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的必需成分［1］。它具有抗氧化性、清除自由基、提高機體免疫力等功效，可預防和治療多種疾病，在治療心臟衰竭、延緩皮膚衰老等方面具有較廣泛的應用［2-4］。因此，經濟生產CoQ10的途徑也變得尤為重要。目前，CoQ10的主要生產方法有：動植物提取法、植物細胞培養法、化學合成法和微生物發酵法。相比其他三種方法，微生物發酵法生產CoQ10具有分離過程相對簡單、產品活性好、可規模放大生產能力等優點，成為最有發展潛力的CoQ10生產方法。要實現發酵法工業化生產CoQ10首先要解決的問題是獲得一株高產菌株。但是自然篩選獲得的菌株產量都很低，需要通過誘變育種、構建工程菌、優化發酵工藝等策略，來最大限度地提高菌株生產CoQ10的能力，以實現CoQ10的工業化生產［5］。

由于CoQ10的生物合成途徑比較復雜，涉及到超過20種中間產物和調控相關反應的酶類。目前通過基因工程方法通過改變某一或某幾個關鍵酶基因的表達來提高發酵菌株中CoQ10的含量并實現工業化生產仍存在一定困難，傳統的物理化學誘變育種手段仍是獲得CoQ10高產菌株的有效方法。鄭君等［6］以球形紅假單胞菌（Rhodopseudomlonas sphaeroides）1.1737T為出發菌株，經紫外線和亞硝基胍誘變，并結合羅紅霉素和對羥基苯甲酸抗性突變株篩選，獲得了一株CoQ10產量為50.6 mg/L的高產突變株PHBR-2，較出發菌株產量提高了90.9%。YOSHIDA H等［7］對類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides）KY-4113進行NTG誘變篩選耐L-乙硫氨基酪酸的突變株，獲得的一株綠色突變株，該株菌可能喪失合成紅色類胡蘿卜素的能力而表達細菌葉綠素，故在肉湯瓊脂培養基上呈綠色菌落，該菌株CoQ10含量比野生株提高20%。

本研究采用超聲輔助酸熱法對類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides）進行CoQ10破壁提取，可實現批量提取菌體中CoQ10。使用紫外-氯化鋰（LiCl）、亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）最佳誘變劑量誘變處理，篩選耐維生素K3（vitamin K3，VK3）、疊氮化鈉（NaN3）、對羥基苯甲酸（para hydroxy benzoic acid，PHBA）等前體物質的CoQ10生產菌株。經過搖瓶發酵初篩、復篩獲得CoQ10高產菌株，并使用單因素與響應面法結合進一步對其發酵培養基組分進行優化［8-10］，以進一步提高CoQ10產量，為CoQ10在國內的工業化生產奠定一定的科學基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides）：由浙江大學于洪巍教授贈送。

1.1.2培養基

種子培養基：葡萄糖3 g/L，酵母提取物8 g/L，NaCl 2 g/L，KH2PO41.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，1 mL/L輔液；用NaOH調pH至7.2。121℃滅菌20 min。

發酵培養基：葡萄糖40g/L，玉米漿干粉3g/L，谷氨酸鈉3 g/L，NaCl 3 g/L，硫酸銨3 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 12.5 g/L，CaCO32 g/L，1 mL/L輔液；用NaOH調pH至7.2。121℃滅菌20 min。

輔液：鹽酸硫胺1 g/L，生物素0.015 g/L，煙酸1 g/L［11］。

1.1.3化學試劑

對羥基苯甲酸、氯化鋰、亞硝基胍、維生素K3、疊氮化鈉、CoQ10標準品，甲醇、乙醇（色譜純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；葡萄糖、酵母提取物、瓊脂粉、氯化鈉、磷酸二氫鉀、MgSO4·7H2O、鹽酸硫胺、生物素、煙酸、NaOH、谷氨酸鈉、硫酸銨、CaCO3、無水乙醇、乙酸乙酯：國藥集團化學試劑有限公司；玉米漿干粉：上海緣肽生物有限公司。

1.2儀器與設備

LC-20AT高效液相色譜：日本島津企業管理（中國）有限公司；UNE500滅菌烘箱：德國MEMMERT公司；SW-CJ-2FD超凈臺：蘇州凈化設備有限公司；TS-2102型搖床：上海天呈科技有限公司；GHP隔水式恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1菌種活化和種子培養液的制備

將甘油管保存的菌種稀釋涂布到基礎平板培養基上，32℃條件下靜置培養7 d；待菌落生長成熟后，挑起平板上單個菌落接入種子培養基，于32℃條件下200 r/min振蕩培養24 h。裝液量均為50 mL/250 mL。

1.3.2發酵培養

取種子培養液以8%（V/V）接種量接入發酵培養基，于32℃條件下200 r/min振蕩培養72 h。

1.3.3CoQ10的超聲輔助酸熱破壁提取

取發酵液1 mL，加入200 μL 0.02 mol/L HCl，70℃、500 W超聲水浴處理15 min。5 000 r/min離心10 min，棄盡上清。加入5 mL提取液（乙酸乙酯∶乙醇=5∶3，V/V），混勻后置于超聲波清洗儀中超聲提取10 min，暗室中抽提15 min，每隔5 min搖勻一次。將抽提液10 000 r/min離心10 min，得CoQ10提取液［12］。

1.3.4CoQ10含量的測定

采用高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）法進行CoQ10含量的測定。HPLC色譜條件：Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶異丙醇=3∶1（V/V）；柱溫40℃；檢測波長275 nm；流速1 mL/min；進樣量20 μL。

CoQ10標準曲線的制作：稱取10 mg的CoQ10標準品溶于50 mL的無水乙醇中，得200 mg/L的CoQ10母液，以此母液出發分別稀釋至質量濃度分別為40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L和160 mg/L的標準溶液。通過HPLC分析獲得CoQ10各標準液質量濃度對應的峰面積，并建立CoQ10質量濃度與峰面積之間的關系曲線。按照CoQ10標準曲線回歸方程計算發酵液中CoQ10的含量。

1.3.5誘變方法

（1）菌懸液的制備

取10 mL對數生長期的類球紅細菌種子培養液，5 000 r/min離心10 min，棄上清，用無菌生理鹽水洗滌兩次，重新懸浮10 mL生理鹽水中，即得菌懸液。

（2）抗性濃度確定

將稀釋后菌懸液分別涂布在含有不同質量濃度疊氮化鈉（NaN3）、對羥基苯甲酸（PHBA）、維生素K3（VK3）和空白的平板培養基中，32℃條件下，培養5 d，觀察菌落生長情況。

（3）化學誘變方法

取1 mL質量濃度為5 mg/mL的亞硝基胍母液加入9 mL菌懸液中，調節終質量濃度為0.5 mg/mL，30℃恒溫水浴振蕩處理10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min后，離心終止反應，稀釋涂布到平板培養基中，后置于32℃避光培養5 d培養，計算活菌數，繪制致死率曲線。致死率計算公式如下：

1.3.6菌株的篩選

（1）初篩

將經過NTG誘變處理30 min后的菌懸液，涂布到含有一定濃度NaN3、PHBA、VK3的平板培養基中，待菌落生長成熟后，從誘變后的平板中挑取顏色變化（除紅色以外的菌株）［14-15］或者平板中相對較大且紅的單菌落，接入斜面培養基中，斜面培養。

（2）復篩

將初篩得到的菌株逐個進行搖瓶發酵培養，測定其CoQ10產量。

（3）突變菌株的遺傳穩定性

將突變株R.sp3-7進行傳代培養，傳代5次，測定其CoQ10產量（每代重復3次），驗證高產菌株的穩定性。

1.3.7發酵培養基配方優化設計

單因素試驗：選擇葡萄糖質量濃度為25 g/L、30 g/L、35 g/L、40 g/L、45 g/L，選擇玉米漿干粉質量濃度為3 g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L，選擇硫酸銨質量濃度為3g/L、4g/L、5 g/L、6 g/L、7 g/L，分別考察葡萄糖、玉米漿干粉及硫酸銨添加量對誘變菌株發酵產CoQ10的影響［16］。

中心組合設計試驗：根據單因素試驗結果選用葡萄糖（X1）、玉米漿干粉（X2）及硫酸銨（X3）添加量為考察因素，以CoQ10產量（Y）為響應值，采用Box-Behnken中心組合試驗設計3因素3水平的響應面分析及驗證試驗，最終獲得最佳培養基配方［17-18］。響應面試驗因素與水平見表1。

表1　響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments g/L

2　結果與分析

2.1CoQ10標準曲線的建立

以CoQ10質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，繪制CoQ10標準曲線，結果見圖1。由圖1可知，CoQ10標準曲線回歸方程為y=0.067 29x，相關系數R2為0.999 96，說明二者線性關系良好［13］。

圖1　輔酶Q10的標準曲線Fig.1 Standard curve of CoQ10

2.2誘變篩選結果

2.2.1抗性平板中VK3、NaN3、PHBA濃度的確定

維生素K3是的結構類似物，作為抗性篩選，可以篩選到突破生物合成中的底物質量濃度反饋抑制的突變株。不同質量濃度維生素K3條件下類球紅細菌出發菌株的生長狀況，結果見表2。由表2可知，維生素K3質量濃度達到10 mg/L時沒有菌落生長，將其作為最低抑菌濃度。

表2　維生素K3最低抑菌濃度的確定Table 2 Determination of minimum inhibitory concentration of vitamin K3

疊氮化鈉具有阻斷電子傳遞鏈中電子從細胞色素氧化酶到氧分子間的傳遞，所以將其作為抗性篩選。不同質量濃度對羥基苯甲酸條件下，類球紅細菌出發菌株的生長狀況，結果見表3。由表3可知，對羥基苯甲酸質量濃度達到10 mg/L時沒有菌落生長，將其作為最低抑菌濃度。

表3　疊氮化鈉最低抑菌濃度的確定Table 3 Determination of minimum inhibitory concentration of NaN3

對羥基苯甲酸是CoQ10生物合成中的前體物質，作為抗性因素，既可以增加CoQ10的合成量，又有可能篩選到解除自身前體物的抑制突變株。不同質量濃度對羥基苯甲酸條件下類球紅細菌出發菌株的生長狀況，結果見表4。由表4可知，對羥基苯甲酸質量濃度達到0.5 g/L時沒有菌落生長，將其作為最低抑菌濃度。

表4　對羥基苯甲酸最低抑菌濃度的確定Table 4 Determination of minimum inhibitory concentration of p-hydroxybenzoie acid

2.2.2亞硝基胍誘變劑量的選擇

圖2　類球紅細菌的NTG誘變致死率Fig.2 Fatality rate ofR.sphaeroides by NTG mutagenesis

NTG為高效誘變劑，能在較低的致死劑量下得到較高的突變率。實驗確定NTG的作用濃度為0.5 mg/mL，分別對出發菌株誘變處理10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min后，通過測定不同劑量下的菌體活菌數，繪制亞硝基胍誘變致死率曲線見圖2。由圖2可知，隨著NTG誘變時間延長，類球紅細菌致死率逐步升高至100%。因此，選擇致死率在80%的作用時間30 min作為最佳誘變劑量，對菌懸液進行誘變處理。

2.2.3高產誘變菌株的篩選

對菌懸液以最佳誘變劑量誘變，涂布到同時含有VK3、NaN3和PHB的平板上，從篩選平板上挑取50株生長良好的單菌落進行初篩和復篩，測定CoQ10產量，篩選結果見圖3。前16株是顏色變化的菌株，其中1～4為黃色，5～7為白色，8～16為粉色；17～50為紅色。對比篩選的各株菌發現，顏色變化的菌CoQ10產量變化幅度較大，且負突變較多，大多數產量遠低于出發菌的產量，但易獲得提高幅度較大的CoQ10生產菌株。其中粉色應是類球紅細菌退化后的菌，產量普遍偏低，篩選時可避開。而平板中相對其他菌落，較大且紅的菌變化幅度雖然不大，但正突變率較大。經篩選選取3株產量較高的菌株（7號、25號、31號三株菌株）斜面甘油管保藏并進行搖瓶復篩，最終選取7號菌株進行后續研究。其是一株白色突變菌株R.sp3-7，CoQ10產量為71.23mg/L，與出發菌株（43.19 mg/L）相比提高了64.92%。該株菌可能喪失合成紅色類胡蘿卜素的能力。

圖3　化學誘變篩選結果Fig.3 Screening results of chemical mutagenesis

2.2.4突變菌株的遺傳穩定性

表5　菌株R.sp3-7的遺傳穩定性Table 5 Genetic stability of strain R.sp3-7

為了驗證高產菌株的穩定性，在實驗中將突變株R.sp3-7在斜面上連續傳代，每代均進行液體發酵，傳代10次，測定其CoQ10產量（每代重復3次），結果見表5。由表5可知，菌體產量較高，波動小，遺傳穩定性好。經過多輪選育，菌落形態較單一。因此，菌株R.sp3-7可作為后續實驗的研究和工業應用。

2.3發酵培養基優化

2.3.1單因素試驗

（1）葡萄糖質量濃度對CoQ10產量的影響

培養基中葡萄糖質量濃度對發酵生產CoQ10的影響，結果見圖4。由圖4可知，葡萄糖質量濃度達到30 g/L時，CoQ10產量達到最大，可以達到（83.39±0.48）mg/L，進一步提高葡萄糖質量濃度則會對CoQ10積累產生一定的抑制作用。故選擇葡萄糖最佳質量濃度為30 g/L。

圖4　葡萄糖質量濃度對輔酶Q10產量的影響Fig.4 Effect of glucose content on the yield of CoQ10

（2）玉米漿干粉質量濃度對CoQ10產量的影響

培養基中玉米漿干粉質量濃度對發酵生產CoQ10的影響，結果見圖5。

圖5　玉米漿干粉質量濃度對輔酶Q10產量的影響Fig.5 Effect of corn steep powder content on the yield of CoQ10

由圖5可知，當玉米漿干粉質量濃度3～6 g/L時，CoQ10產量不斷增加，并在玉米漿干粉質量濃度為6g/L時，CoQ10產量達到最大值（82.23±0.58）mg/L，進一步提高玉米漿干粉的質量濃度則不利于CoQ10產量的積累。故選擇玉米漿干粉質量濃度為6 g/L。

（3）硫酸銨質量濃度對CoQ10產量的影響

培養基中硫酸銨質量濃度對發酵生產CoQ10的影響，結果見圖6。由圖6可知，當硫酸銨質量濃度為5 g/L時，CoQ10產量達到最大值（80.43±0.46）mg/L，繼續增加硫酸銨質量濃度，CoQ10產量反而降低，這表明過多的硫酸銨并不利于CoQ10的形成。這可能是由于硫酸銨為無機氮源，而發酵液里已有有機氮源，過多的NH4+不利于菌體生長和CoQ10合成。故選擇硫酸銨的最佳質量濃度為5 g/L。

圖6　硫酸銨質量濃度對輔酶Q10產量的影響Fig.6 Effect of（NH4）2SO4content on the yield of CoQ10

2.3.2響應面優化提取條件

（1）模型的建立及顯著性檢驗

根據單因素試驗的結果，參照Box-Behnken試驗方案，對葡萄糖（X1）、玉米漿干粉（X2）、硫酸銨（X3）質量濃度3個因素進行響應面試驗優化，結果見表6。

表6　響應面試驗設計及結果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

用Design-Expert V8.0.6軟件，對表6進行多元回歸擬合，可以得到CoQ10產量（Y）對葡萄糖（X1）、玉米漿干粉（X2）、硫酸銨（X3）的回歸方程為：Y=-609.378 50+23.742 80X1+ 54.65983X2+65.30725X3-9.53333E-003X1X2+2.19020X1X3-4.352 67X2X3-0.558 71X12-2.765 22X22-10.319 75X32。對試驗結果進行顯著性檢驗及方差分析，結果見表7。

表7　回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

由表7可知，方差模型顯著性P值為0.000 9＜0.05，表明該模型是顯著的，方程擬合度較好；同時失擬項的P值為0.072 2＞0.05，說明模型失擬不顯著，殘差由隨機誤差引起，模型有效；該方程決定系數R2=0.980 5，說明方程的擬合程度較好，該模型能較好地預測發酵培養基組分與CoQ10產量的關系；校正決定系數R2Adj=0.945 4，表明方程模型可信度較高，能夠較好地描述試驗結果［19］。

（2）響應面優化及分析

根據BB試驗設計結果做出三維響應面，結果見圖7。由圖7可知，該方程的拋物線圖形開口均向下，說明方程存在最大值，即響應面范圍覆蓋了最大值所在的區域。當葡萄糖質量濃度一定時，CoQ10產量隨著玉米漿干粉質量濃度增加而增大，但當玉米漿干粉質量濃度＞5.63 g/L時，CoQ10產量呈下降趨勢。當玉米漿干粉質量濃度一定時，隨著葡萄糖質量濃度的增加，CoQ10產量也隨之增大，但當葡萄糖質量濃度繼續增大時，CoQ10產量逐漸降低。等高線的形狀可以反映因素間交互作用的強弱，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著。結果表明，葡萄糖與玉米漿干粉交互作用不顯著，而葡萄糖與硫酸銨和玉米漿干粉與硫酸銨交互作用顯著［20］。

通過Design-Expert軟件，進行分析計算，可得最佳發酵培養基配方為：葡萄糖31.66 g/L、玉米漿干粉5.63 g/L，（NH4）2SO45.34 g/L，在此條件下，CoQ10產量的預測最大值為94.57 mg/L。考慮到實際培養基的配制，最終確定這3個因素的質量濃度分別為：葡萄糖31.7 g/L、玉米漿干粉5.6 g/L、（NH4）2SO45.3 g/L。

圖7　葡萄糖、玉米漿干粉和硫酸銨質量濃度交互作用對輔酶Q10產量影響的響應面和等高線Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interaction between of glucose，corn steep powder and（NH4）2SO4content on the yield of CoQ10

（3）優化培養基的驗證

為了驗證試驗結果的可靠性，按上述最終培養基參數進行驗證試驗，3次重復實驗的CoQ10產量分別為94.41 mg/L、93.53 mg/L、92.96 mg/L，平均值為（93.63±0.59）mg/L，與預測值只相差1%，表明此模型是可行有效的，能夠較好的描述試驗結果。

3　結論

本試驗采用NTG化學誘變，結合VK3+NaN3+PHBA三種抗性的代謝控制育種方法，考察了不同顏色突變株生產CoQ10的產量變化情況。篩選獲得一株CoQ10高產白色誘變菌株R.sp3-7，其CoQ10產量為71.23 mg/L，遺傳穩定性良好，比出發菌株提高了64.922%。在單因素試驗的基礎上，采用BB試驗設計，對其發酵培養基進行了優化，通過響應面法對試驗數據進行優化與評價，得到影響CoQ10產量的二次多項式回歸模型，并對該模型進行顯著性檢驗。最終得到優化的培養基為：葡萄糖31.7 g/L，玉米漿干粉5.6 g/L，（NH4）2SO45.3 g/L，MgSO4·7H2O 12.5 g/L，谷氨酸鈉3 g/L，NaCl 3 g/L，KH2PO43 g/L，CaCO32 g/L，輔液1 mL/L。在此條件下，測得CoQ10產量為（93.63±0.59）mg/L，與預測值（94.57 mg/L）相差不大。因此，采用響應面法優化類球紅細菌培養基組成穩定可行。綜上所述，代謝控制育種方法和響應面法優化培養基都為后續進一步深入研究打下了良好的基礎。同時，也可為其他菌種的選育提供一定參考借鑒。

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FU Jiaolong，QIAN Dawei*，WU Chenqi，XU Minqiang，HU Cuiying，LI Liangzhi
（School of Chemical and Biological Engineering，Suzhou University of Science and Technology，Suzhou 215009，China）

Using multiple resistance of vitamin K3，NaN3and p-hydroxybenzoie acid（PHBA）as selective marker，CoQ10-producingRhodobacter sphaeroideswas mutated by nitrosoguanidine（NTG），and the high CoQ10-producing strains was screened.The fermentation medium was optimized by response surface methodology.Results showed that a strain R.sp3-7 with genetic stability and high CoQ10-production was obtained by mutation breeding.The optimum component of fermentation medium was glucose 31.7 g/L，corn steep powder 5.6 g/L，（NH4）2SO45.3 g/L，sodium glutamate 3.0 g/L，NaCl 3.0 g/L，MgSO4·7H2O 12.5 g/L，KH2PO43.0 g/L，CaCO32.0 g/L and auxiliary fluids 1 ml/L.Under the conditions，the yield of CoQ10produced by mutant strain R.sp3-7 was up to（93.63±0.59）mg/L，which was increased by 116.8%than that produced by original strain.

CoQ10；resistant plate；chemical mutagenesis；response surface methodology；Rhodobacter sphaeroides

TS201.3

0254-5071（2016）06-0090-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.019

2016-03-27

蘇州市科技計劃項目（sYN201317）；蘇州科技學院科研基金項目（XKZ201411）

扶教龍（1969-），男，副教授，博士，研究方向為生物化工、發酵工程。

錢大偉（1991-），男，碩士研究生，研究方向為生物化工、微生物育種。