冬果梨果酒酵母的篩選及鑒定

劉根娣，隋明

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030；2.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都610065；3.四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院酒類與食品工程系，四川都江堰611830）

冬果梨果酒酵母的篩選及鑒定

劉根娣1，隋明2，3*

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030；2.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都610065；3.四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院酒類與食品工程系，四川都江堰611830）

以冬果梨作為富集培養(yǎng)基，對野生酵母菌株進行收集、分離，得到980株；采用TTC平板法、耐乙醇性能測定以及產(chǎn)乙醇性能測定共三級篩選，最終篩得一株可耐受18%vol乙醇、乙醇產(chǎn)量達7.79%vol、發(fā)酵過程中糖利用率92.75%的菌株L-0301。通過對篩選所得菌株L-0301的形態(tài)特征觀察、26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析方法對菌株進行分類鑒定，結(jié)果顯示，菌株L-0301為酵母亞科酵母屬釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）。

冬果梨；果酒；酵母；篩選；鑒定

果酒是以水果為原料經(jīng)過發(fā)酵而成的低酒精度飲料，富含糖、有機酸、酯類及多種維生素［1］。目前，我國的果酒種類以葡萄酒為主，以其他果品發(fā)酵生產(chǎn)較少。我國幅員遼闊，果樹種類眾多，鮮果市場受到季節(jié)性和地域性的影響，即使價格低廉，亦難走向全國鮮果市場。果酒營養(yǎng)豐富市場廣闊，貨架期相對鮮果要長很多。因此，對此類果品進行深加工發(fā)酵生產(chǎn)果酒，既是對低品質(zhì)水果的升值，又能因地制宜合理利用資源。

酵母菌（Saccharomyces）是一種在自然界分布較廣的、能發(fā)酵糖類又具有較強還原氧化能力的單細胞真菌［2］，并將相關(guān)化學(xué)合成的醇、醛進行轉(zhuǎn)化生產(chǎn)出乙醇。在果酒發(fā)酵的過程中，酵母菌是關(guān)鍵所在，優(yōu)良的酵母菌株是決定果酒產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素［3-4］。為了獲得適合利用蘭州冬果梨進行發(fā)酵產(chǎn)果酒的酵母菌株，本研究擬從未經(jīng)任何處理的蘭州冬果梨中采樣，篩選產(chǎn)酒性能較好的菌株，從形態(tài)特征結(jié)合分子水平的26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析方法對所篩得菌株進行分類鑒定。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1原料與試劑

冬果梨：蘭州市售；菌株XA0、XA5、XA10、XA12、XA14、XA24、LC、LD：西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院微生物實驗室提供；菌株AS2.587：甘肅省工業(yè)微生物菌種保藏中心；葡萄糖：廣州和為化工有限公司；蛋白胨、瓊脂：天津北辰方正試劑廠；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）：上海圻明生物科技有限公司；無水乙醇：廣州市新成精細化工有限公司；以上化學(xué)試劑均為分析純。脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒和膠回收試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：將冬果梨用粉碎機打碎，糖度及pH自然。

增殖培養(yǎng)基：麥芽汁液體培養(yǎng)基，自制，糖度12°Bx，自然pH，121℃滅菌20 min。

分離培養(yǎng)基采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母提取物1%，瓊脂2%，加蒸餾水溶解，自然pH值，121℃滅菌20 min。

活化培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母提取物1%，加蒸餾水溶解，自然pH值，121℃滅菌20 min。

生長培養(yǎng)基：經(jīng)3 000 r/min離心處理10 min處理后的冬果梨汁，其中的糖近似于可溶性固形物，糖含量調(diào)節(jié)至20%，不足部分用蔗糖調(diào)節(jié)，121℃滅菌20 min。

TTC上層培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%，瓊脂1.5%，加水加熱溶解，然后吸取9.5 mL加入試管中121℃滅菌20 min，加入5%TTC溶液使其濃度為0.5%，混勻。

TTC下層培養(yǎng)基：同生長培養(yǎng)基。

玉米粉瓊脂Dalmau平板培養(yǎng)基：將42 g玉米粉加入1 L去離子水中60℃加熱1 h，用濾紙過濾再加水至1 L，加入12 g瓊脂溶解，121℃滅菌15 min。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基（麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基）：葡萄糖0.1%，KCl 0.18%，酵母抽提物0.25%，CH3CO2Na·3H2O 0.82%，瓊脂1.5%，加入蒸餾水，121 ℃滅菌15 min。

1.2儀器與設(shè)備

BCN-1360超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；LD4-8離心機：北京京立離心機有限公司；HZQ-QX全溫振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；HB-119手持式糖度計：鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱：上海森信試驗儀器有限公司；DYCZ-20G型電泳儀、WD-9402B型基因擴增儀、WD-9413A凝膠成像分析系統(tǒng)：北京六一儀器廠。

1.3方法

1.3.1酵母菌的富集及分離

將冬果梨粉碎成糊狀，置于自然環(huán)境中3 d進行富集。吸取1 mL冬果梨富集液放于裝有20 mL增殖培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，于28℃、100 r/min條件下培養(yǎng)24 h。吸取1 mL含菌增殖培養(yǎng)基用無菌水稀釋到一定梯度，均勻涂布于分離培養(yǎng)基中，于（28±1）℃倒置培養(yǎng)3～5 d后觀察。

1.3.2酵母菌的篩選

一級篩選（TTC平板法）：按照參考文獻［5］的方法進行。

二級篩選（耐乙醇性能測定）：按照參考文獻［6］的方法進行。

三級篩選（產(chǎn)乙醇性能的測定）：將試驗菌株于活化培養(yǎng)基活化后，吸取5 mL放入45 mL糖含量為30%（近似可溶性固形物）的發(fā)酵培養(yǎng)基中，先在28℃、100 r/min的條件下發(fā)酵24 h，在28℃靜置發(fā)酵至72 h，然后測定發(fā)酵液中的乙醇含量及各菌株對冬果梨發(fā)酵液中糖的利用情況。

1.3.3酵母菌的鑒定

798 Effect of negative polarity electret on dielectric properties and hypoglycemic effects of insulin

參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》和《微生物學(xué)實驗技術(shù)》［7-8］觀察菌株的形態(tài)特征，設(shè)計生理生化試驗，包括發(fā)酵糖類試驗、同化碳源試驗、同化氮源試驗及其他生理生化試驗等。

26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析方法鑒定：在YPD斜面培養(yǎng)基上用接種環(huán)挑取少量旺盛生長的酵母菌細胞于50 μL PCR緩沖液中，變性后離心，取上清液作為模板［9］。在80℃、15 min的反應(yīng)條件下，按參照文獻［6］所提供的方法，提取DNA，檢測后置于-20℃冰箱保藏備用。使用由上海生工公司合成的引物NL1（5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′）和NL4（5′-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3′）［10］進行26S rDNA D1/D2區(qū)的目的片段擴增。PCR擴增體系條件為（50 μL體系）：PCR緩沖液1 μL，混合液5 μL，D1/D2正向引物（20 pmol/μL）0.5 μL，D1/D2反向引物（20 pmol/μL）0.5 μL，最后加dH2O 23 μL。PCR循環(huán)為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性0.5 min，55℃退火0.5 min，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃保持5 min［11］。將得到的PCR產(chǎn)物交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行純化和測序。以Chromas作參照，對測序結(jié)果進行正反序列圖譜人工校對，用校正后的26SrDNAD1/D2區(qū)序列在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行序列的搜索（BLAST search），比較供試菌株與已知酵母菌相應(yīng)序列的同源性。為了更進一步的了解供試菌株與已知酵母菌的親緣關(guān)系及其分類地位，根據(jù)在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索得到的已知酵母菌的26S rDNA D1/D2區(qū)序列，并將其下載，與供試菌株序列一起用Clustal X［12］軟件進行匹配排列，用MEGA5.05軟件中的Kimura2-Paramete Distance模型及鄰接法（Neighbor-joining，NJ）分析構(gòu)建統(tǒng)發(fā)育樹，并進行1 000次的Bootstraps檢驗［13］。

1.3.4檢測方法

乙醇含量的測定方法：蒸餾法［14］；糖含量的測定方法：糖度計法。

2　結(jié)果與分析

2.1酵母菌的富集分離

從冬果梨中共分離得到980株酵母菌供一級篩選。

2.2酵母菌的篩選

2.2.1一級篩選

2.2.2二級篩選

從一級篩得到的136株性狀較好的菌株，進行二級篩選，實驗重復(fù)3次。分別在不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液中培養(yǎng)72 h，并在生長期間的3個時間段分別觀察了各發(fā)酵管的產(chǎn)氣情況，結(jié)果見表1。由表1可知，菌株L-0239、L-0242、L-0245、L-0256、L-0257、L-0280、L-0292、L-0293、L-0301、 L-0305、L-0308、L-0311仍有的產(chǎn)氣情況，說明這些菌株比其他菌株具有更強的乙醇耐受能力，其產(chǎn)生乙醇的能力也可能會更大。

表1　菌株耐乙醇測定結(jié)果Table 1 Determination results of ethanol-tolerance of strains

2.2.3三級篩選

用二級篩選所得的12株菌和其他實驗室提供的8株菌進行試驗。經(jīng)發(fā)酵后，測定發(fā)酵液中的乙醇產(chǎn)量以及發(fā)酵前后醪液中的糖含量。結(jié)果見表2。

表2　乙醇產(chǎn)量測定結(jié)果Table 2 Determination results of ethanol yield

由表2可看出，菌株L-0301的乙醇產(chǎn)量在這20株菌中最高，達到7.79%vol，對冬果梨梨汁中的糖的利用率也最高，為92.75%，殘?zhí)亲畹蜑?.45%。

2.3菌株的鑒定

2.3.1菌株的形態(tài)特征

菌株L-0301的細胞形態(tài)特征為：培養(yǎng)液澄清、沉淀較多但結(jié)合不緊密、瓶壁無膜、無環(huán)島狀菌蹼；形狀呈卵圓形、檸檬形；一端出芽或兩端出芽，如圖1所示。

圖1　菌株L-0301細胞形態(tài)特征Fig.1 Cell morphology of strain L-0301

菌株L-0301的菌落形態(tài)特征為：菌落質(zhì)地呈奶酪狀，粘稠，乳白色，反光、光滑、無疣狀脊?fàn)钔黄稹o發(fā)毛樣突起，平滑，有隆起，如圖2所示。

假菌絲的觀察：在玉米粉瓊脂Dalmau平板上，培養(yǎng)基經(jīng)過7 d的培養(yǎng)觀察，發(fā)現(xiàn)無假菌絲形成。

子囊孢子觀察：在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，挑取少許菌苔于載玻片的水滴上，經(jīng)涂片、熱固定后，加數(shù)滴孔雀綠，l min后水洗，加95%vol乙醇20 s，水洗，最后用0.5%沙黃液復(fù)染20s，水洗去染色液，最后用吸水紙吸干。制片干燥后，鏡檢，經(jīng)過培養(yǎng)染色鏡檢后發(fā)現(xiàn)，菌株有子囊孢子的形成，每個子囊內(nèi)的孢子數(shù)為5～8個，呈卵圓形，如圖3所示。

圖2　菌株L-0301菌落形態(tài)特征Fig.2 Colonial morphology of strain L-0301

圖3　菌株L-0301子囊孢子特征Fig.3 Ascospores characteristics of strain L-0301

2.3.2生理生化試驗

表3　菌株L-0301生理生化試驗結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical experiments results of strain L-0301

菌株L-0301的發(fā)酵糖類試驗、同化碳源試驗、同化氮源試驗以及其他生理生化試驗［15］結(jié)果見表3。根據(jù)試驗結(jié)果參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》，初步確定菌株L-0301屬于酵母屬。

2.3.326S rDNA D1/D2區(qū)序列分析方法鑒定

用提取到的菌株L-0301的DNA作為模板，以引物NL1（5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′）和NL4（5′-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3′）進行26S rDNA D1/D2區(qū)的目的片段擴增，再對PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析［16］，結(jié)果如圖4所示。

圖4　菌株L-0301 26S rDNA D1/D2區(qū)PCR擴增凝膠電泳圖Fig.4 26S rDNA D1/D2 PCR amplification electrophoretogram of strain L-0301

由圖4可見，PCR擴增產(chǎn)物大小在500～600 bp。菌株L-0301的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測序后可知其大小為586 bp的片段，結(jié)果如下：

登錄NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對后可知，菌株L-0301與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）序列的相似度＞99%。同時采用MEGA 5.05軟件Neighbor-Joining法將L-0301與其他相關(guān)菌株的26SrDNAD1/D2區(qū)的基因序列一起構(gòu)建成了系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行1 000次的相似度重復(fù)性計算，結(jié)果如圖5。由圖5可見，系統(tǒng)發(fā)育樹以Aspergillus flavus、Saccharom yces naganishii和Saccharomyces humaticus的26S rDNA D1/D2區(qū)的基因序列為外群，而L-0301則以較高的置信度和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）模式菌株CBS 1907T聚于內(nèi)群的同一分支上，而與其他菌株分在不同的分支上，說明L-0301與釀酒酵母（Saccharomyces cere-visiae）模式菌株CBS 1907T具有較近的親緣關(guān)系。將L-0301基因序列與相關(guān)模式菌株的26S基因序列進行同源性分析，從堿基序列的同源性來看，其與CBS 1907T的同源性為99%，L-0301與CBS 1907T應(yīng)該屬于同一物種，即菌株L-0301為酵母亞科（Saccharomycestoideae）酵母屬（Saccharomyces）釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）。

圖5　基于菌株L-0301 26S rDNA D1/D2區(qū)基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on the 26S rDNA D1/D2 domain sequence alignment of strain L-0301

3　結(jié)論

通過對冬果梨中的酵母菌進行富集、分離，得到了980株酵母菌。以這些菌株作為出發(fā)菌株，通過TTC平板法、耐乙醇能力的測定以及產(chǎn)乙醇能力的測定共三級的篩選，最終得到了菌株L-0301，其具有良好的產(chǎn)乙醇性能以及乙醇耐受性能。通過初步的篩選發(fā)酵便可以得到更能耐受18%vol的乙醇，乙醇產(chǎn)量7.79%vol，發(fā)酵過程糖的利用率為92.75%。

本研究通過形態(tài)特征觀察并結(jié)合26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析的方法，對從冬果梨中分離篩選出的的野生菌株L-0301行了分類鑒定。菌株L-0301形態(tài)特征與《酵母菌的特征與鑒定手冊》中闡述的釀酒酵母的性質(zhì)相似。通過分子水平的26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析，與相關(guān)釀酒酵母的模式菌株進行比較，進一步確定了菌株L-0301為酵母亞科（Saccharomycestoideae）酵母屬（Saccharomyces）釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）。本研究結(jié)果為以冬果梨為原料生產(chǎn)果酒的研究奠定了優(yōu)良菌種的基礎(chǔ)，有關(guān)該酵母菌的發(fā)酵特性及其利用價值還需做進一步研究。

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LIU Gendi1，SUI Ming2，3*
（1.College of Life Science and Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030，China；2.College of Light Industry，Textile&Food Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065，China；3.Department of Wine and Food Engineering，Sichuan Technology&Business College，Dujiangyan 611830，China）

980 wild yeast strains were isolated and screened from Dongguo pear.Using TTC plate method screening，ethanol tolerance determination and ethanol production determination，one strain L-0301 was screened，with the characteristic of 18%vol ethanol tolerance，ethanol yield 7.79%vol，sugar utilization ratio 92.75%.Strain L-0301 was identified through morphological characteristics observation，26S rDNA D1/D2 sequence analysis，the results showed that strain L-0301 wasSaccharomyces cerevisiae.

dongguo pear；fruit wine；yeast；screening；identification

TS261.1

0254-5071（2016）06-0085-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.018

2015-12-13

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目（zyz2012073）；四川省教育廳課題（13ZB0363）

劉根娣（1977-），女，講師，碩士，研究方向為果蔬產(chǎn)品開發(fā)及利用。

隋明（1986-），男，講師，博士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。