超高壓誘變選育富鋅啤酒酵母菌株的研究

陳情情，許秀勤，馬艷，馬龍，許暉，李娜

（蚌埠學院生物與食品工程系，安徽蚌埠233000）

超高壓誘變選育富鋅啤酒酵母菌株的研究

陳情情，許秀勤，馬艷，馬龍*，許暉，李娜

（蚌埠學院生物與食品工程系，安徽蚌埠233000）

以啤酒酵母為出發菌株，采用超高壓誘變方法誘變選育高富集鋅的酵母菌株。優化了超高壓處理的工藝條件，并基于菌株對鋅離子的耐受性和富集性，對菌株進行篩選。結果表明，培養10 h的啤酒酵母菌處于對數生長期，適宜于誘變；超高壓處理壓力250 MPa、保壓時間20 min為誘變的最佳工藝條件；成功選育出一株高富集鋅的突變菌株，其細胞鋅含量達2.75 mg/g，是出發菌的6.55倍。

富鋅酵母；啤酒酵母；超高壓處理；誘變育種

鋅是人體必需的微量元素之一，對維持機體內部蛋白質、碳水化合物、脂類、核酸的正常代謝，維持細胞膜的完整性和再生，促進身體生長發育等方面起著重要作用［1］。但是只有有機態的鋅元素才能夠被機體安全且迅速地吸收，無機態的鋅不僅被吸收的水平很低，而且毒性較大；利用微生物將無機鹽形式的鋅元素轉化為較易被人體和動物吸收利用的有機物形式的鋅是目前鋅元素利用的重要手段，其中富集微量元素能力極強的酵母菌成為該領域的研究熱點［2］。國內外學者對富鋅酵母的營養特性、發酵培養基和發酵工藝條件作了大量研究［3-5］，同時也對生產菌株進行了一系列的誘變和篩選，包括紫外誘變、化學誘變劑誘變等方法［6-7］，以進一步提高酵母鋅的產量，但存在輻射性和毒性的局限。超高壓誘變技術是一種采用100 MPa以上的壓力對微生物進行誘變處理的新型、安全的微生物育種方法［8］。超高壓作為一種逆境脅迫，對微生物的生理功能以及核酸結構和基因表達有著較大影響，已得到學術界的廣泛關注［9-10］。該技術現已廣泛應用于各類酵母菌的誘變育種［11-12］，但應用在富鋅酵母的育種未見報道。本研究采用超高壓誘變育種法對實驗室保存的啤酒酵母菌株進行選育，成功地篩選出一株富鋅能力強的正突變菌株，為工業生產用菌株的選育提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種來源

啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：蚌埠學院生物與食品工程系微生物實驗室保存。

1.1.2培養基與溶液［13］

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養基：葡萄糖20 g，酵母提取物10 g，胰蛋白胨20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.5。

YPD固體培養基：YPD液體培養基中加入瓊脂20 g。

硫酸鋅儲備液：使用去離子水配制濃度0.10 mol/L的硫酸鋅溶液，用濃硫酸調節pH值4.0防止沉淀物產生，115℃滅菌20 min，需要時加入已滅菌的培養基中。

1.2儀器與設備

HPP.L2-600/0.6型超高壓處理設備：天津市華泰森淼生物工程技術有限公司；DZ-400/2C型真空包裝機：上海青葩包裝機械有限公司；ZWY-100H型搖床：上海智誠儀器制造有限公司；752型紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；TAS-990型原子吸收分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌懸液的制備

取斜面保存的啤酒酵母菌種接入裝有5 mL YPD固體培養基的試管中28℃靜置培養48 h進行活化。刮取3環已活化的菌種至裝有50 mL YPD液體培養基的150 mL三角瓶中28℃、150 r/min搖瓶培養24 h進行擴大培養。取擴大培養后的啤酒酵母菌液10 mL于4℃、4 000 r/min離心10 min，沉淀以無菌生理鹽水洗滌3次，用生理鹽水調整至細胞濃度為106CFU/mL，輕微振蕩30 min使菌體分散均勻，制得菌懸液。

1.3.2生長曲線的繪制

將啤酒酵母菌懸液以10%的接種量分別接入12瓶裝有30 mL YPD液體培養基的250 mL三角瓶中，于28℃、150 r/min搖瓶培養，每隔2 h取出一瓶，從中吸取1 mL培養液于4℃、4 000 r/min離心10 min，以無菌生理鹽水洗滌3次，加入4mL無菌生理鹽水使菌體重新懸浮，以生理鹽水為空白，在波長600 nm處測定吸光度值，以培養時間為橫坐標，光密度OD600nm值為縱坐標繪制啤酒酵母生長曲線［14］。

1.3.3啤酒酵母菌株的耐鋅能力測定

分別吸取0.10 mol/L硫酸鋅溶液10 μL、20 μL、30 μL、40 μL、50 μL、60 μL、70 μL、80 μL、90 μL、100 μL到無菌平板，加入10 mL加熱呈液態的斜面固體培養基，趁熱搖勻，冷卻即得鋅離子終濃度0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8 mmol/L、0.9 mmol/L、1.0 mmol/L的系列平板。吸取200 μL啤酒酵母菌懸液涂布平板，于28℃倒置培養72 h，觀察平板，能夠長出啤酒酵母菌落的最高鋅離子濃度即為啤酒酵母菌對鋅離子的耐受濃度［7］。

1.3.4超高壓處理壓力對啤酒酵母菌株誘變的影響

將培養至對數生長期的啤酒酵母制備成細胞濃度為106CFU/mL的菌懸液，在無菌操作條件下將5 mL菌懸液轉入滅菌的聚丙烯包裝袋內，用真空包裝機封口，設置50 MPa、100 MPa、150 MPa、200 MPa、250 MPa、300 MPa、350 MPa、400 MPa、450 MPa不同壓力梯度高壓處理20 min，吸取200 μL處理后的菌懸液涂布平板培養，同時以出發菌株作為空白對照。待平板上長出菌落后，根據菌落數計算致死率。

將培養至對數生長期的啤酒酵母制備成細胞濃度為106CFU/mL的菌懸液，在無菌操作條件下將5 mL菌懸液轉入滅菌的聚丙烯包裝袋內，用真空包裝機封口，在250 MPa壓力條件下分別保壓處理5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，吸取200 μL處理后的菌懸液涂布平板培養，同時以出發菌株作為空白對照。待平板上長出菌落后，根據菌落數計算致死率。

1.3.6突變菌株的篩選

從致死率在70%～80%的250 MPa、20 min誘變處理的平板中挑取生長快、較大的單菌落，經無菌生理鹽水適當稀釋后涂布于兩倍耐受濃度環境平板上培養，同時以出發菌株作為空白對照。在空白對照不生長的情況下，挑取生長出的菌落接入更高濃度（如4倍和8倍耐受濃度）鋅平板上馴化，并做傳代培養，測定細胞含鋅量，其中細胞含鋅量高的菌落即為優良突變菌株。

1.3.7啤酒酵母細胞鋅含量的測定

采用國家標準GB/T 5009.14—2003《食品中鋅的測定》中的原子吸收光譜法。

2　結果與分析

2.1出發菌的生長曲線

通過比濁法測定啤酒酵母的生長曲線，結果見圖1。

圖1　啤酒酵母的生長曲線Fig.1 Growth curve ofSaccharomyces cerevisiae

由圖1可知，啤酒酵母的對數生長期在8～16 h范圍內，培養18 h后啤酒酵母進入穩定期。研究表明，處于對數生長期的菌體生長旺盛、代謝活性強，對誘變因素敏感［15］。因此，選擇培養10 h的啤酒酵母菌液進行超高壓誘變處理。

信息技術在財會工作中的應用，在一定程度上減少了財會人員的工作量，但對財務人員的要求并未降低。管理會計主要是為企業管理者在制定決策時提供有效、及時的意見或建議，如企業決策中的控制、決策、分析等工作，均需具有較高專業素質的財會工作者提供理論支持。因此，企業財會工作者必須不斷提升自身專業能力，可從員工績效管理能力、業績評價能力、決策分析能力、財務核算能力等方面作為切入點，進一步健全自身知識體系。財務人員在提高自身專業能力同時，也應增加相關領域的知識累積，如經濟分析識別、資本運營、公司治理等。

2.2出發菌的耐鋅能力

觀察鋅離子濃度梯度系列平板上菌生長情況，能長出菌落的最高鋅離子濃度即為該菌株對鋅離子的最大耐受濃度。出發菌株耐鋅能力測定結果見表1。

表1　啤酒酵母對鋅離子的耐受能力Table 1 Zinc resistance ofSaccharomyces cerevisiae

由表1可知，在規定的培養時間內，隨著平板中鋅離子濃度的增加，出發菌菌落數量在不斷地減少，在鋅離子濃度0.8 mmol/L時菌落數最少，在鋅離子濃度為0.9 mmol/L、1.0 mmol/L時沒有菌落生長。因此，0.8 mmol/L為啤酒酵母出發菌對鋅離子的最大耐受濃度。

2.3超高壓處理壓力對啤酒酵母菌株誘變影響

固定高壓處理時間為20 min時，超高壓處理壓力對啤酒酵母致死率的影響結果見圖2。

圖2　壓力對啤酒酵母菌致死率的影響Fig.2 Effect of processing pressure onSaccharomyces cerevisiae lethality rate

由圖2可知，超高壓處理可導致啤酒酵母細胞的死亡，隨著壓力的升高其致死率迅速增大；當處理壓力達到250 MPa時，啤酒酵母細胞的致死率達到80%左右，而壓力超過400 MPa時菌體幾乎全部死亡。研究表明，致死率在70%～80%時微生物出現正突變較高［16］，故選取壓力250 MPa作為最優處理壓力。

2.4保壓時間對啤酒酵母菌致死率的影響

在250 MPa壓力處理條件下，不同保壓時間對啤酒酵母致死率的影響結果見圖3。

圖3　保壓時間對啤酒酵母菌致死率的影響Fig.3 Effect of processing time onSaccharomyces cerevisiae lethality rate

由圖3可知，隨著保壓時間的延長，啤酒酵母菌的致死率也在迅速增大；當保壓時間達到20 min時，細胞致死率最高可以達到80%，處理時間超過25 min，細胞的致死率變化緩慢。故從經濟成本考慮，選取超高壓保壓時間為20 min。綜上，超高壓誘變處理啤酒酵母的最優誘變參數為壓力250 MPa、保壓時間20 min。

2.5篩選突變菌株

超高壓處理后的啤酒酵母菌株經過鋅濃度梯次增加的馴化培養后，在4倍耐受濃度（3.2 mmol/L）平板上生長了3株啤酒酵母，標記為UP1、UP2、UP3。將初篩出的三株菌株連續傳代5代，測定細胞含鋅量，并與出發菌株比較，結果見表2。

表2　啤酒酵母細胞含鋅量測定結果Table 2 Determination of zinc content inSaccharomyces cerevisiae

由表2可知，啤酒酵母菌株經過超高壓誘變處理后富集鋅元素的能力均得到大幅度提高，其中菌株UP2提高最大，細胞鋅含量達到2.75 mg/g，是出發菌的6.55倍，故菌株UP2可確定為最終獲得的優良富鋅酵母菌株。

3　結論

研究結果表明，超高壓技術是一種可行的微生物誘變育種方法，能夠顯著地提高啤酒酵母富集鋅元素的性能。采用壓力250MPa、保壓時間20min對處于對數生長期的啤酒酵母菌株進行超高壓誘變處理，成功選育出一株富集鋅元素能力強的突變菌株，其細胞鋅含量達到2.75 mg/g，是出發菌的6.55倍，這一突變菌株遺傳穩定性良好，可作為富鋅酵母生產用工業菌株。超高壓誘變技術操作簡便、無污染，在微生物誘變育種領域具有較好的應用前景。

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CHEN Qingqing，XU Xiuqin，MA Yan，MA Long*，XU Hui，LI Na
（Department of Food and Bioengineering，Bengbu College，Bengbu 233000，China）

UsingSaccharomyces cerevisiaeas starting strain，high zinc-enrichedS.cerevisiaemutant strain was breeded by ultra-high pressure mutagenesis method.The conditions of ultra-high pressure processing were studied and then the screening was performed based on the tolerability and enrichment of mutant strains to zinc.The results showed that the strains in logarithmic growth phage after 10 h culture were suitable for the mutation，pressure value 250 MPa，pressure time 20 min were the optimal processing conditions for mutation.Finally，a strain with high enrichment of zinc（cell content 2.75 mg/g，about 6.55 times of the starting strains）was obtained.

zinc enriched yeast；Saccharomyces cerevisiae；ultra-high pressure processing；mutation breeding

TS202.3

0254-5071（2016）06-0081-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.017

2016-02-22

安徽省高等學校省級自然科學研究項目（KJ2013B136）；蚌埠學院教師指導學生參與教師科研項目（2013xsky17）；安徽省高等學校省級卓越工程師計劃蚌埠學院食品科學與工程專業建設點；安徽省高等學校省級卓越工程師計劃蚌埠學院食品質量與安全專業建設點

陳情情（1993-），女，本科生，研究方向為食品科學與工程。

馬龍（1979-），男，副教授，博士，研究方向為食品科學。