糯米酒釀造酵母的優選

楊子琳，伍時華，趙東玲，黃翠姬，楊麗峰

（廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006）

糯米酒釀造酵母的優選

楊子琳，伍時華，趙東玲*，黃翠姬，楊麗峰

（廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006）

為了優選酵母菌種，改善液態發酵糯米酒的口感，采用釀酒酵母SJ4、扣囊復膜酵母3-1Y、粟酒裂殖酵母SP單菌種發酵及釀酒酵母/扣囊復膜酵母（1∶1）、釀酒酵母/粟酒裂殖酵母（1∶1）、釀酒酵母/扣囊復膜酵母/粟酒裂殖酵母（1∶1∶1）混合菌種發酵方式釀造糯米酒，通過曲線下面積（AUC）、主成分分析（PCA）對糯米酒風味物質及理化指標進行分析。結果表明，扣囊復膜酵母3-1Y與釀酒酵母SJ4（1∶1）混合發酵時AUC值最小，為9 371，相對貢獻值最大，為3.448 7；糯米酒中總酸和氨基酸態氮含量有所提高，產品共檢測了12種風味物質，總酯含量有增加，甲醇及高級醇有所降低，感官評分為7分，最適用于糯米酒的發酵。

糯米酒；酵母菌；優選；主成分分析；風味物質

糯米酒富含氨基酸、多糖、維生素等營養成分［1］，因液態釀造糯米酒能有效縮短發酵周期［2］，解決了傳統發酵勞動強度大、生產周期長的問題，成為工藝研究的重點。酵母是酒曲中主要的發酵菌，酵母菌種的優劣直接影響糯米酒的品質［3］，以往研究的側重點多是從糯米酒或是酒曲中篩選酵母菌［4］，或是為了保證糯米酒中適當的酒精度，片面篩選發酵能力較強的釀酒酵母，所得糯米酒口味淡薄，風味欠佳［5-6］。近年來有關產香能力較強的非釀酒酵母的研究逐年增多，釀酒酵母與非釀酒酵母混合發酵中酵母之間的相互作用和風味物質的差異分析也成為研究的熱點［7］。

為了得到適合于糯米酒液態發酵的酵母菌，改善糯米酒的口感，本試驗選取米根霉8-3M作為唯一的糖化霉菌，采用釀酒酵母SJ4、扣囊復膜酵母3-1Y、粟酒裂殖酵母SP單菌種發酵及釀酒酵母/扣囊復膜酵母（1∶1）、釀酒酵母/粟酒裂殖酵母（1∶1）、釀酒酵母/扣囊復膜酵母/粟酒裂殖酵母（1∶1∶1）混合菌種發酵方式釀造糯米酒，采用曲線下面積（area under curve，AUC）、主成分分析（principal component analysis，PCA）等分析手段比較各理化指標、風味物質的差異，優選出適用于糯米酒液態發酵的酵母菌株，為糯米酒工業化生產奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1原料與試劑

糯米：市售。甲醇（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；氫氧化鈉（分析純）：廣東光華科技股份有限公司；高溫α-淀粉酶（20 000 U/mL）：山東隆大生物工程有限公司；無水乙醇（色譜純）：上海展云化工有限公司；白酒成分分析標準物質（色譜純）：貴州省計量測試院。

1.1.2發酵菌株

米根霉（Rhizopus oryzae）8-3M、扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）3-1Y、栗酒裂殖酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）SP、釀酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）SJ4：本課題組實驗室保藏。

1.1.3培養基

酵母菌種子培養基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH自然，在115℃條件下高壓蒸汽滅菌30 min。

霉菌種子培養基：200 g糯米加水浸泡4 h，將浸泡好的糯米瀝干后置于水浴鍋中，加水至剛剛浸沒糯米，待溫度上升至60℃時以10 U/g的接入量加入耐高溫α-淀粉酶，90℃水浴保溫2 h，冷卻后過濾，加水定容至1 L，分裝成50 mL/瓶，115℃條件下高壓蒸汽滅菌30 min。

糯米液態發酵培養基：按照50 g/瓶的量，稱取糯米加水浸泡4 h后瀝干，加水至剛剛浸沒糯米，置于水浴鍋中，待溫度上升至60℃時以10 U/g的接入量加入耐高溫α-淀粉酶，90℃保溫2 h，冷卻后加水定量至200 g/瓶，打漿，115℃條件下高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2儀器與設備

LS-B35L-I立式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫療設備有限公司；SW-CJ-TB標準凈化工作臺：蘇州集團蘇州安泰空氣技術有限公司；HWY-2112恒溫調速搖床柜：上海智誠分析儀器制造有限公司；SGD-IV還原糖測定儀：山東省科學院生物研究所；GC7890-Ⅱ氣相色譜儀：上海天美科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌懸液和液態曲的制備

霉菌孢子、酵母菌懸浮液的制備方法見文獻［8］。

霉菌液態曲制備：將霉菌孢子懸浮液，按105個/mL接種量接入霉菌種子培養基中，30℃、120 r/min培養32 h即為霉菌液態曲。

1.3.2分析檢測方法

（1）理化成分分析

酒精度、總糖、總酸、氨基酸態氮含量的測定參照國標GB/T 13662—2008《黃酒》［9］的方法進行。

（2）風味物質分析

采用氣相色譜法（內標法）。氣相色譜條件：TM-930白酒專用毛細管柱（25 m×0.53 mm×0.1 μm）；載氣為氮氣（N2）；采用程序升溫：起始溫度45℃保持3 min，以3.5℃/min上升至62℃，以1℃/min上升至67℃，再以25℃/min上升至200℃保持6 min；進樣口、檢測器溫度220℃；采樣結束時間30 min。內標物為乙酸丁酯，含量為34.17 mg/100 mL。1.3.3混合發酵接種方式

非釀酒酵母SP、3-1Y與釀酒酵母SJ4混合發酵采用順序接種方式：先分別將粟酒裂殖酵母SP、扣囊復膜酵母3-1Y按1∶1的混合比接入滅菌后的液態糯米發酵培養基中，搖床120 r/min、28℃條件下培養24 h，再以與各非釀酒酵母相同的接種量接入釀酒酵母SJ4（總接種量為106個/mL），搖床120 r/min，28℃的培養條件繼續發酵2.7 d，糯米酒中還原糖含量趨于穩定，發酵結束。

1.3.4糯米酒釀造工藝流程

糯米→浸米→高溫液化→打漿分裝→滅菌→接種霉菌→糖化→接種酵母→酒精發酵→酒醪分離→巴氏滅菌→糯米酒

操作要點：

（1）浸米：常溫浸米4 h以上，至米粒能用手指捻碎。（2）高溫液化：用60℃溫水浸沒糯米，以10 U/g的量加入耐高溫α-淀粉酶，水浴鍋中90～95℃保溫2 h。

（3）打漿：按照料水比1∶3（g∶mL）在打漿機中低速打漿5 min。

（4）分裝滅菌：以200 g/瓶的量分裝糯米漿，115℃蒸汽滅菌30 min。

（5）接種霉菌糖化：將8-3M液態曲全部接入滅菌冷卻后的糯米發酵培養基中，30℃、搖床120 r/min糖化36 h。

（6）接種酵母發酵：將酵母菌懸浮液按106個/mL的總接種量接入糖化好的糯米發酵培養基中，28℃、搖床120r/min的條件下發酵。

（7）酒醪分離：4 000 r/min離心糯米酒發酵液5 min。（8）巴氏滅菌：將糯米酒液70℃滅菌30 min后急速冷卻至4℃。

1.3.5統計分析

采用Microsoft Excel、Origin、Graphpad Prism 5和主成分分析對實驗數據進行統計分析。

2　結果與分析

2.1單一及混合酵母發酵對糯米酒理化性質的影響

表1　單一及混合酵母發酵對糯米酒理化指標的影響Table 1 Effects of single and mixed yeasts fermentation on physicochemical indexes of glutinous rice wine

單一及混合酵母發酵糯米酒的理化指標檢測結果見表1。由表1可知，單一和混合酵母發酵糯米酒的理化性質差異顯著（P＜0.05）。與SJ4單菌種發酵相比，3-1Y/SJ4（1∶1）與SP/SJ4（1∶1）混合發酵糯米酒的酒精度與之相當，總酸含量卻分別提高了11.7%、27.8%，氨基酸態氮含量亦分別提高了19.8%、34.8%，糯米酒中總酸和氨基酸態氮含量的升高標志著糯米酒品質的提高［10-11］。因此釀酒酵母SJ4與非釀酒酵母3-1Y、SP的兩兩混合（1∶1）發酵，在保證產品酒精度的同時能提升糯米酒的品質。

2.2單一及混合酵母發酵對糖代謝的影響

單一及混合酵母發酵對糯米酒還原糖含量的影響結果見圖1。由圖1可知，還原糖含量在發酵時間0～9 h，在根霉8-3M的糖化作用下逐漸升高，后來隨著酵母對還原糖的吸收和利用又逐漸降低。單一和混合酵母發酵對還原糖的消耗速度差異性顯著（P＜0.05），得出不同屬酵母在發酵過程中對還原糖的吸收速率不同。

圖1　單一及混合酵母發酵對糯米酒還原糖含量的影響Fig.1 Effects of single and mixed yeasts fermentation on reducing sugar content of glutinous rice wine

曲線下面積法可以評價整體的耗糖快慢，殘還原糖曲線下面積越小，耗糖越快［12］。單一及混合酵母發酵糯米酒的還原糖變化曲線下面積結果表2。

表2　單一及混合酵母發酵對糯米酒還原糖曲線下面積的影響Table 2 Effects of single and mixed yeasts fermentation on reducing sugar area under curve of glutinous rice wine

由表2可知，AUCSJ4＜AUC3-1Y/SJ4＜AUCSP/SJ4＜AUCSP/3-1Y/SJ4＜AUCSP＜AUC3-1Y，故3種不同屬酵母單菌種發酵時，SJ4消耗還原糖的速度最快，其次是粟酒裂殖酵母SP，扣囊復膜酵母3-1Y最慢。當2種非釀酒酵母分別與SJ4混合發酵的耗糖速度與其單菌種發酵時相比明顯提高：AUC3-1Y/SJ4與AUC3-1Y相比降低了59.2%，AUCSP/SJ4與AUCSP相比降低了32.9%。但酵母3-1Y/SP/SJ4（1∶1）混合發酵的耗糖速度低于3-1Y/SJ4（1∶1）和SP/SJ4（1∶1）混合發酵，可能是因為2種非釀酒酵母的過度增殖與SJ4產生競爭性抑制作用［13-14］，導致發酵時間延長。3種混菌發酵方式中3-1Y/SJ4（1∶1）混合發酵的AUC值最小為9 371，表明其耗糖快，發酵時間短。結果表明，釀酒酵母SJ4能快速消耗還原糖轉變為酒精，具有較強的發酵能力。利用SJ4這種發酵特性將其與非釀酒酵母進行混合發酵，與非釀酒酵母單菌種發酵相比，能夠提高發酵過程中還原糖的消耗速率，改善非釀酒酵母單菌種發酵時發酵時間長的問題。

2.3單一及混合酵母發酵對糯米酒風味物質的影響

混標、單一及混合酵母發酵糯米酒樣品中10種主要的風味物質在1.3.2的氣相條件下進行分析，氣相色譜圖見圖2，各風味物質含量結果見表3。

圖2　混標（A）及酵母3-1Y與SJ4混合（1∶1）發酵糯米酒樣品（B）的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of mixed standards（A）and glutinous rice wine sample（B）by yeast 3-1Y：yeast SJ4（1∶1）mixed fermentation

醇、酯類風味物質是酵母在發酵過程中產生的次級代謝產物，對白酒的風味具有重要的影響［15］。由表3可知，SJ4與SP單菌種發酵時甲醇含量依次為（417.4±1.7）mg/L、（99.2±0.6）mg/L，異丁醇含量依次為（321.3±2.3）mg/L、（334.5±3.1）mg/L。甲醇能刺激視神經，含量過高可致人失明，異丁醇能夠引起飲用者的頭痛，含量過高會影響酒的品質［16］。而酵母3-1Y單菌種發酵時發酵能力弱，糯米酒中不僅酒精度低，高級醇含量也很低。故3種不同屬酵母的單菌種發酵均不適用于糯米酒的液態釀造。

與SJ4單菌種發酵相比，混合發酵均能使糯米酒中甲醇含量明顯降低，這對改善糯米酒的品質有重要作用。3-1Y/SJ4（1∶1）、SP/SJ4（1∶1）、SP/3-1Y/SJ4（1∶1∶1）混合發酵中高級醇含量降低分別為SJ4單菌種發酵時的7.61%、29.2%、 32%，總酯含量升高是SJ4單菌種發酵的3.47倍、3.21倍、5.95倍。結果表明，混合菌種發酵能使糯米酒中高級醇含量降低、酯類物質含量升高，這對改善糯米酒的風味和口感有重要的意義。

表3　單一及混合酵母發酵對糯米酒中風味物質含量的影響Table 3 Effects of single and mixed yeasts fermentation on flavor compounds contents in glutinous rice wine mg/L

2.4主成分分析法確定最佳酵母組合

主成分分析（PCA）也稱主分量分析，該方法利用降維的思想，將多指標的變量通過線性變換、計算特征值等轉化成少數幾個綜合指標的數理統計方法［17］。單一及混合酵母發酵所得糯米酒中的10種風味物質含量，在Minitab15分析軟件中運用統計菜單中的主成分分析過程進行分析，得到特征值、貢獻率、累計貢獻率、載荷圖（見圖3）和分值圖（見圖4）。由圖3可知，第一分量（PC1）所占比率為48.9%，第二分量（PC2）所占比率為31%，兩個分量的累計貢獻率為79.9%，故此分析結果可靠；對第一分量影響較大的依次為異丁醇、仲丁醇、正丁醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、甲醇，對第二分量影響較大的依次為丁酸乙酯、異戊醇、正丙醇。

圖3　單一及混合酵母發酵糯米酒中風味物質載荷圖Fig.3 Load diagram of flavor compounds in glutinous rice wine fermented by single and mixed yeasts

圖4　單一及混合酵母發酵糯米酒中風味物質分值圖Fig.4 Score diagram of flavor compounds in glutinous rice wine fermented by single and mixed yeasts

由圖4可知，SJ4、SP、3-1Y三種屬酵母混合發酵的PC1值最高為2.821 5，SJ4與3-1Y混合發酵的PC2值最高為2.60369。計算2種發酵方式的相對貢獻率（PC1×PC2）大小，SJ4與3-1Y混合發酵的貢獻率大于SJ4、SP、3-1Y三種屬酵母混合發酵，因此確定SJ4與3-1Y的混合發酵是最佳酵母屬組合方式。

2.5不同酵母釀造糯米酒的感官評分

將不同酵母釀造的糯米酒進行感官評價，結果見圖5。

由圖5可知，不同酵母釀造糯米酒的感官評分由大到小依次為：SJ4/3-1Y＞SJ4/SP/3-1Y＞SJ4＞3-1Y＞SJ4/SP＞SP。其中SP單菌種發酵的糯米酒中因混雜較明顯的臭味導致感官評分最低僅為2.3分，3-1Y/SJ4混合發酵酒香氣飽滿、口味清爽，感官評分最高為7分（滿分10分計）。以上結果與主成分分析所得結果基本一致，說明主成分分析法在一定程度上適用于液態發酵糯米酒酵母菌種優選。

圖5　單一及混合酵母發酵糯米酒的感官評分Fig.5 Sensory evaluation of glutinous rice wine fermented by single and mixed yeasts

3　結論

本實驗對2種非釀酒酵母（扣囊復膜酵母屬3-1Y、粟酒裂殖酵母屬SP）和釀酒酵母SJ4進行了單一及混合菌種發酵研究。結果表明，不同屬酵母之間發酵特性及代謝產物含量差異巨大：釀酒酵母與非釀酒酵母分別有很強的耗糖和產酯能力。釀酒酵母和非釀酒酵母的混合發酵，在保證發酵效率的同時能使糯米酒中酯類物質含量增加，低級醇含量降低。利用主成分分析法（PCA）對單菌種及混合菌種發酵糯米酒的風味物質進行分析，得出酵母3-1Y+SJ4混合發酵的相對貢獻值最大為3.448 7，糯米酒中總酸和氨基酸態氮含量有所提高，產品共檢測了12種風味物質，總酯含量有增加，甲醇及高級醇有所降低，感官評分為7分（滿分10分），最適用于糯米酒的發酵。

通過研究不同屬酵母單菌種及混合菌種在液態發酵糯米酒中的發酵特性，并用主成分分析法分析糯米酒中風味物質含量從而優選出最佳釀造菌種，以上研究方法為大規模篩選最佳工業酵母菌株提供參考依據。

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YANG Zilin，WU Shihua，ZHAO Dongling*，HUANG Cuiji，YANG Lifeng
（College of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China）

In order to select excellent yeast strains and improve the taste of glutinous rice wine produced by liquid fermentation，the glutinous rice wine was brewed by single yeast（Sacchromyces cerevisiaeSJ4，Saccharomycopsis fibuligera3-1Y，orSchizosaccharomyces pombeSP）and multi-yeast（S.cerevisiaeSJ4∶S.fibuligera3-1Y（1∶1），S.cerevisiae SJ4：S.pombe SP（1∶1），or S.cerevisiae SJ4∶S.fibuligera3-1Y∶S.pombeSP（1∶1∶1））fermentation method.The flavor compounds and physicochemical indexes of glutinous rice wine were analyzed by area under the curve（AUC）and principle component analysis（PCA）.The results showed that at the mixed fermentation ofS.cerevisiaeSJ4∶S.fibuligera3-1Y∶S.pombeSP（1∶1∶1），the AUC value（9 371）was the least and the relative contribution value（3.448 7）was the largest.The content of total acid and amino acid nitrogen in glutinous rice wine were increased，and 12 kinds of flavor compounds in the wine were detected，the total esters content was increased，methanol and higher alcohols were decreased.The sensory score was 7，which was the most suitable for the glutinous rice wine fermentation.

glutinous rice wine；yeast；selection；principle component analysis；flavor compounds

TS261.1

0254-5071（2016）06-0060-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.013

2016-03-09

廣西科技攻關項目（桂科攻0782003-2）

楊子琳（1990-），女，碩士研究生，研究方向為代謝控制發酵。

趙東玲（1965-），男，工程師，博士，研究方向為生物工程。