耐高糖酵母篩選及其高糖脅迫機制的研究進展

朱寶生，劉功良，2*，白衛東，2，顏曉青

（1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東廣州510225；2.廣州市廣式傳統食品加工與安全控制重點實驗室，廣東廣州510225）

耐高糖酵母篩選及其高糖脅迫機制的研究進展

朱寶生1，劉功良1，2*，白衛東1，2，顏曉青1

（1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東廣州510225；2.廣州市廣式傳統食品加工與安全控制重點實驗室，廣東廣州510225）

耐高糖酵母菌在濃醪酒精發酵過程中起著重要的作用。目前，國內外對耐高酒精度酵母菌有較為廣泛深入的研究，而對耐高糖酵母菌的研究還尚有不足。該文介紹了耐高糖酵母的篩選及其高糖脅迫應急機制的研究進展，并對耐高糖酵母的發展趨勢進行展望，指出酒精發酵所需酵母菌應生理耐受性較好，能耐高糖度、高酒度、高滲壓等，能夠抵抗極端不良環境，在工業生產中能夠有效提高乙醇的產量。通過篩選耐高糖酵母菌，旨在為酵母菌高糖脅迫機理的研究提供參考。

篩選；馴化；基因；高糖脅迫；機制

耐高糖酵母是一種能夠在含高濃度糖的環境中進行生長、發酵產生乙醇和二氧化碳的真菌，其轉化能力強，繁殖能力快，能夠在高滲的惡劣環境中進行發酵［1-3］。濃醪發酵是酒精工業生產的新趨勢，這種發酵工藝所生成的酒精濃度較高，同時醪液中的糖度也高，具有很好的應用價值［4-5］。在發酵初期高濃度底物（如葡萄糖）以及后期逐漸積累的乙醇所產生的各種壓力會對細胞產生毒害作用，致使酵母細胞內水分活度、細胞質組成發生顯著變化，導致細胞膜和胞內酶受到破壞，從而抑制酵母的生長，導致發酵延后，影響發酵產量［6-7］。提高酵母耐受能力，降低產物對酵母發酵的毒害作用和高滲透壓對細胞的抑制作用，是提高發酵效率、降低成本的關鍵。

酵母菌本身存在一套系統對滲透壓進行調節，在高糖脅迫下存在多種信號傳導途徑和分子應答機制［8-11］。由于酵母滲透壓調節系統的表達方式和強弱程度不同，對外界環境表現出的耐高糖性能也有明顯差異，而且，來源不同的酵母，其耐受高濃度糖的性能也會有差別［12-16］。因此，耐高糖酵母的篩選是開展耐受機制研究的基礎。酵母菌耐受高糖機制的研究對指導菌株改造和探討酵母細胞生命現象具有重要意義。

1　篩選方法

在篩選耐高糖酵母菌的過程中最為重要的就是選擇高濃度糖環境，從高糖環境中篩選出來的酵母菌必然是耐受高糖的酵母菌，現有的耐高糖酵母多數來源于果汁、甘蔗糖蜜、酒精發酵醪液等樣品。耐高糖酵母的篩選方法主要有三種：自然篩選、誘變育種和基因工程育種。

1.1自然篩選

菌種在自然的生態環境中、漫長的時間里，通過不斷的變異、進化，適應環境的變化，而發生性能上的改變，不需要人為手段去改造而篩選出滿足人類意愿的方法就是自然篩選，又叫自然突變篩選。自然篩選是獲得耐高糖酵母的途徑之一，取材于自然，來源廣泛。從自樣品中篩選較理想生產菌種的一般步驟：采集菌樣→富集培養→菌種分離→性能鑒定。

邱巨香等［17］從中蜂蜜與意蜂蜜中篩選獲得耐高糖酵母菌且都為魯氏結合酵母。王英等［18］采用鏡檢和杜氏管發酵法初篩，分離出19株酵母菌，通過產酒精能力和耐性能力測試進行復篩，最終確定LM-8為最優酵母，從自然發酵藍莓果酒中分離篩選出優良酵母。齊向輝等［19］在耐高糖鑒定及其產多元醇分析中利用高糖選擇性富集培養技術，從天然高糖蜂巢和蜂蜜環境中篩選到99株耐高糖酵母菌。

1.2誘變育種

誘變育種是在人為的條件下，利用物理、化學的因素，誘變生物產生突變，從中選擇培育新的微生物。這種方法基本上建立于逐步提高培養基中糖濃度方法的基礎上。最為常用的是通過誘變對出發酵母菌耐高糖性能進行人工篩選馴化。誘變育種的一般步驟：自然篩選→富集培養菌種分離→菌種純化→人工誘變→逐級篩選→性能鑒定。根據誘變的方式，可分成紫外線誘變和自然馴化。

1.2.1紫外線誘變

在酵母菌的分離篩選中，最常用的是紫外線誘變法，該方法操作簡單，出現正突變的機率很高。趙碩等［1］以實驗室保存的酵母菌株作為出發菌，采用紫外誘變和馴化，篩選能應用于蘋果酒發酵的酵母菌。結果表明，最佳的誘變條件是在15 W紫外燈，照射距離20 cm，照射時間40 s等，在該條件下最終篩選出的2株目的菌株，在65%的糖度下仍能發酵，且結果良好，5 d后酒精度達11%vol以上。徐日益等［20］以釀酒酵母AS2.1189為出發菌，經過紫外誘變100代，篩選得到耐高滲性能較好的B2和A17菌株。

1.2.2自然馴化

自然馴化是酵母菌篩選最基本的篩選方法，該方法可操作性強，方向性明確。張勇等［21］通過逐步提高培養液濃度的方法，將AS2612、AS2614、AS2400、AS2420四種酵母，分別定向馴化成DP1、DP2、DP3、DP4四株耐高滲的適宜釀制蜂蜜酒的酵母，經發酵力對比試驗和釀制蜂蜜酒實驗，結果表明，DP酵母的發酵力顯著提高，發酵蜜酒的周期縮短了一倍以上，成品酒風味更佳。田景芝等［22］以蜂蜜為原料，從蜂蜜中獲的野生出發酵母菌，分別制備糖度為15%、20%、25%、30%、35%五個梯度，將已制備好的菌懸液加入五種蜂蜜溶液中進行發酵，篩選出耐受糖度為30%的酵母菌。還利用實驗室保存酵母A1、A2、A3按照糖度逐級遞升的原理馴化出耐39BX-40BX的酵母。熊雅蘭等［23］通過對野生型甘蔗糖蜜發酵高產乙醇菌株MF1002的呼吸突變菌株MF15C進行馴化，發現MF15C比MF1002耐高糖發酵效果要好。

1.3基因工程育種

紫外線輻射和自然突變誘導，篩選工作量大，突變具有多樣性，不穩定性，篩選時有點盲目，效果比較差。隨著基因技術的發展，基因工程育種漸漸的被人們認可，該方法可操作性強，目的性明確，效果好。

基因工程育種是利用基因重組、克隆等基因工程技術對菌種進行改造，獲得目的菌種的方法。基因工程育種的一般步驟：自然篩選→富集培養菌種分離→菌種純化→基因工程育種→逐級篩選→性能鑒定。

沈玉平［24］通過在god基因前端插入起胞外分泌作用的α-淀粉酶信號肽系列，使酶能夠高效分泌到胞外，通過基因組改組酶控，獲得能夠耐受高初始糖，高溫條件下的發酵菌株。張曉陽等［25］通過代謝工程與全基因組重組構建成釀酒酵母抗逆高產乙醇。

2　耐高糖機制

目前，酵母菌耐高糖機制的研究主要包括應激物代謝機制研究、氧化應激機制研究及剛興起的基因耐性機制研究。

2.1應激物代謝機制

MORAN J W等［26］發現耐高滲酵母具有活躍的磷酸戊糖途徑，能夠通過胞內累計海藻糖等相容性物質來適應不同的發酵環境。李曉軍等［27］研究了指數生長期的釀酒酵母在高滲脅迫下的生理代謝，研究結果表明，甘油和海藻糖是釀酒酵母的主要相容性溶質。在30%高糖環境下，胞外酒精質量濃度、甘油質量濃度、海藻糖質量濃度分別較對照提高100%、400%和11%。彭酈等［28-29］研究了在高糖培養基條件下釀酒活性干酵母AWRIR2的生長及胞內海藻糖代謝情況。結果表明在180～400 g/L的高葡萄糖含量下釀酒酵母均能正常生長，其中300 g/L條件下釀酒酵母生長良好。隨著初始糖濃度增加，胞內海藻糖量迅速增加，在400 g/L的葡萄糖含量下，胞內海藻糖積累量達48.73 mg/g（濕質量）。同時，還研究了高糖脅迫下低溫對釀酒酵母AWRIR2生理特性的影響。其結果表明，20℃時不同高糖量（250 g/L、300 g/L、350 g/L）對釀酒酵母細胞生長、底物消耗及海藻糖積累影響不同。海藻糖積累量明顯高于對照組，說明該菌株有較高的抗高滲能力。20℃低溫條件下，海藻糖積累均高于25℃和30℃。對于酵母細胞來說20℃也是逆境刺激，但低溫與高滲環境對酵母的協同作用機理還有待進一步研究。苗君［30］采用無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）培養基，在高濃度糖條件下（葡萄糖組YNB培養基+20%葡萄糖或果糖）培養細胞，同時檢測細胞內蛋白和胞外分泌蛋白以及胞外有機酸的代謝變化。研究結果表明，釀酒酵母2144在高濃度糖條件下培養，對數生長期降糖迅速，進入穩定期后降糖開始穩定；培養液的pH值與正常相比初期下降速度較快，進入穩定期后趨勢基本一致；酵母細胞內海藻糖含量隨糖濃度的增加迅速積累；酵母胞內外甘油含量迅速增加，正常條件培養細胞的甘油含量基本不變。酵母在極端高濃度糖條件下生長，為了適應環境的變化，細胞內蛋白的代謝發生變化，出現了蛋白條帶的增加和消失。特別是胞外的分泌蛋白，小分子量分泌蛋白差異性很明顯。酵母中蘋果酸、檸檬酸、乳酸和α-酮戊二酸4種胞外有機酸的代謝受到了高糖濃度的影響，代謝變化趨勢差異性很大。ABERTNY J等［31］認為細胞通過相容性溶質甘油主動調節胞內物質的濃度來適應這種高糖濃度環境。

2.2氧化應激機制

熊雅蘭等［23，32］通過測定在30%高糖脅迫下菌株的生長速率、出芽率、乙醇產量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、過氧化氫酶活力、過氧化物酶活力以及細胞質和線粒體的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶活力，研究了野生型甘蔗糖蜜發酵高產乙醇菌株MF1002及其糖分利用能力顯著提高的呼吸突變菌株MF15C在高糖脅迫下的生理特性變化。研究結果表明，糖分利用能力顯著提高的釀酒酵母呼吸突變體MF15C較始發菌株MF1002具有更強的高糖耐受性受高糖脅迫時，兩菌株的胞內SOD、胞內過氧化氫酶、胞內過氧化物酶、細胞質ATP酶和線粒體ATP酶等的活力均顯著上升，并指出這4種酶均參與了釀酒酵母的高糖脅迫反應，其活性可能與MF15C菌株的高糖耐受能力有關，可作為指導進一步改造該菌株的生理指標。

2.3基因耐性機制

隨著基因技術的發展，耐高糖酵母基因耐性機制的研究越來越受關注。張曉陽等［25］將釀酒酵母海藻糖代謝工程與全基因重組技術相結合，獲得具有較高耐糖性和優良乙醇發酵性能的釀酒酵母菌株，并認為海藻糖代謝工程與雜交介導的全基因組重組相結合的技術途徑可提高釀酒酵母抗逆生長與乙醇發酵性能。在270 g/L的高葡萄糖濃度發酵條件下，3株二倍體工程菌（Z12ptpsl、Z12△athl、Z12pT△A）與原始出發二倍體菌株Zd4比較，主發酵速率分別提高9.9%、8.3%、11.4%，乙醇產量依次分別提高4.9%、3.9%、7.0%，與其胞內海藻糖含量高于其他菌株、在脅迫條件下具有更強耐逆境能力相一致。STEFAN H［14］發現海藻糖合成酶基因依賴C-AMP蛋白質激酶的基因、酪氨酸磷酸酶基因、3-磷酸甘油脫氫酶基因，還有sho1、sln1、hog1、roc2、ssk1、ssk2、ssk22、rck2、ptc1、ptc2等基因。LAM F H［33］通過增強S288C的PMA1基因和TRK1基因的表達，提高了酵母菌耐高糖和耐高乙醇性能。

3　結語與展望

目前，酵母在高糖脅迫下應激代謝機制及氧化應激機制已是當下耐高糖機制研究的重點。開展耐高糖酵母研究所用到的糖度均在30%～60%范圍內［2，34］，對于60%糖度以上的耐高糖酵母及其耐受研究尚少見報道；現有的酵母菌耐高糖機制研究都固定在某一個濃度開展［2，4］，不同濃度高糖脅迫下應激機制研究尚屬空白。因此，酵母耐受高糖的機制研究仍需進一步深入開展。

此外，對微生物耐高糖脅迫機制的研究都只是局限于分子水平，通過研究只是發現耐高糖酵母菌和產生于胞外相容性物質例如海藻糖、甘油、有機酸等對酵母菌耐高糖脅迫有一定的相關性，而無法完全清楚闡述酵母菌耐高糖機制，若能發現一株耐高糖的酵母菌，通過DNA提取、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增、質粒酶切電泳、比對基因庫等一系列手段對耐高糖酵母進行基因測序，再對與酵母耐高糖性能相關的基因進行敲除，設置幾組實驗，通過比較未敲除基因后的酵母與敲除相關基因的酵母在高糖環境下的起酵能力，來驗證酵母的耐高糖作用基因。測定后的作用基因可經體外DNA重組技術處理，改造現有的非耐高糖酵母以獲得耐高糖性能，測定重組后酵母菌的穩定性，從而可從基因水平闡述其耐高糖機制。

氧化應激機制和代謝物應激機制是當前微生物耐高糖脅迫機制研究最主要的兩大方面內容。酵母菌氧化應激機制表達即酒精酵母受胞內SOD、胞內過氧化氫酶、胞內過氧化物酶、細胞質ATP酶和線粒體ATP酶等酶活的影響，乙醇產量發生動態變化。酵母菌應激物代謝機制主要是酵母受某些代謝物影響，乙醇的產量變化。而這些代謝應激物主要有胞外甘油、胞內海藻糖和胞外有機酸。酶是氧化應激機制的關鍵，而代謝應激物是應激物代謝機制的關鍵。目前，這兩大機制方面都取得了較大的進展。但是，對這兩大機制的關系還不甚了解，若把氧化應激機制的酶活測定和代謝物應激機制的代謝物放于糖酵解、三羧酸循環、磷酸戊糖途徑等構建的代謝網絡中進行研究分析，測定酶、代謝物種類、含量，進行定性和定量分析，通過方程擬合，模型建立，將酶和代謝物關系化、線性化，更能深刻的揭示酵母菌耐高脅迫機制的研究。

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ZHU Baosheng1，LIU Gongliang1，2*，BAI Weidong1，2，YAN Xiaoqing1
（1.College of Light Industry and Food，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China；2.Key laboratory of Traditional Cantonese Food Processing and Safety Control，Guangzhou 510225，China）

High-sugar-tolerant yeasts play an important role in the process of thick mash alcoholic fermentation.At present，the high-ethanol-tolerant yeasts have an in-depth study home and broad，but lack of study on high-sugar-tolerant yeast.In this paper，the screening of high-sugar-tolerant yeast and the research on high sugar stress mechanism were introduced.The development trend of the high-sugar-tolerant yeast was forecasted.The paper pointed out that yeast used in alcoholic fermentation should have better physiological tolerance，such as high sugar tolerance，high alcohol tolerance，and high osmotic pressure tolerance，etc.To withstand extreme adverse environment，the high-sugar-tolerant yeast is important in improving the industrial production of ethanol content.Screening of high-sugar-tolerant yeast will provide a reference for the research about high sugar stress mechanism.

screening；domestication；gene；high sugar stress；mechanism

TS201.3

0254-5071（2016）06-0011-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.003

2016-01-06

廣東省自然科學基金項目（2015A030313598）；廣東省高等學校優秀青年教師培養計劃項目（YQ2015094）；廣東省普通高校特色創新項目（2015KTSCX068）；廣州市科技計劃項目（201509010005）；廣東普通高校省級重大科研項目［粵教科函［2015］3號］；廣東省省部產學研合作專項（2013B090600157）；廣東省省級大學生創新創業訓練計劃項目（201411347056）

朱寶生（1990-），男，碩士研究生，研究方向為發酵工程。

劉功良（1980-），男，副教授，博士，研究方向為發酵工程。