掃描探針顯微技術(shù)測(cè)量血管內(nèi)皮細(xì)胞的彈性

徐崢，段俊麗，錢(qián)夢(mèng)騄，程茜

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掃描探針顯微技術(shù)測(cè)量血管內(nèi)皮細(xì)胞的彈性

徐崢1，段俊麗2，錢(qián)夢(mèng)騄1，程茜1

(1. 同濟(jì)大學(xué)物理科學(xué)與工程學(xué)院，上海200092； 2. 上海交通大學(xué)附屬醫(yī)學(xué)院新華醫(yī)院老年科，上海 200092 )

血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能與許多疾病間存在關(guān)聯(lián)，但現(xiàn)在對(duì)其功能好壞的定量描述仍十分少見(jiàn)。該文以?xún)?nèi)皮細(xì)胞的彈性作為衡量其功能的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)理論建立壓痕測(cè)量楊氏模量的計(jì)算方法，并利用掃描探針顯微鏡從實(shí)驗(yàn)上得到了正常及過(guò)氧化氫處理過(guò)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的楊氏模量。發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化氫處理后細(xì)胞的楊氏模量升高，表明通過(guò)楊氏模量來(lái)表征細(xì)胞活性是可行的。

內(nèi)皮細(xì)胞；掃描探針顯微鏡；楊氏模量；活性

0 引言

血管內(nèi)皮細(xì)胞是鋪在血管內(nèi)壁的細(xì)胞，它位于血液和血管組織基底膜之間，厚度在微米數(shù)量級(jí)。在血管中，內(nèi)皮細(xì)胞主動(dòng)傳輸小分子、大分子和激素，并在調(diào)節(jié)血壓、凝血、血管新生里起到至關(guān)重要的作用[1]。G. Favero 等研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮功能紊亂與心血管疾病及糖尿病有著緊密的聯(lián)系[2]。也有研究表明內(nèi)皮細(xì)胞功能異常會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化[3]、出血性疾病、免疫功能紊亂、移植排斥，甚至造成死胎等[1]。內(nèi)皮細(xì)胞的研究對(duì)預(yù)防和治療這些疾病起著至關(guān)重要的作用。現(xiàn)在，越來(lái)越多的研究從生理和病理上研究其功能并建立了一系列的離體模型，已有研究者研究了內(nèi)皮細(xì)胞功能對(duì)血管舒張性，凝血、新生、淋巴細(xì)胞黏附、遷移，以及血管信號(hào)和傳輸通路等的影響。然而，從細(xì)胞出發(fā)，以?xún)?nèi)皮細(xì)胞的力學(xué)特性來(lái)對(duì)其定量描述的研究仍十分少見(jiàn)。

近年來(lái)隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米生物力學(xué)和納米生物醫(yī)學(xué)是迅速興起的生物醫(yī)學(xué)研究前沿。在細(xì)胞尺度上開(kāi)展生理和病理學(xué)的研究，可以更深刻地揭示疾病的起因，為相關(guān)嚴(yán)重疾病的診療和康復(fù)提供更有效的途徑[4-5]。掃描探針顯微鏡如今正迅速發(fā)展為新型的表面結(jié)構(gòu)成像的有力工具，相對(duì)電子顯微鏡技術(shù)，掃描探針顯微技術(shù)不但可對(duì)絕緣體和導(dǎo)體進(jìn)行成像，更可以對(duì)浸潤(rùn)在液體(如生理鹽水)中的樣品進(jìn)行成像，使生物樣品在掃描中仍可維持生命。現(xiàn)在，掃描探針顯微鏡已被廣泛用以得到生物體材料的形貌及表面彈性[6-8]。

當(dāng)用針尖產(chǎn)生納米壓痕時(shí)，掃描探針顯微鏡可逐點(diǎn)測(cè)量微小區(qū)域、彈性較小且表面彈性不均勻材料的力曲線(xiàn)。樣品由于探針微壓痕產(chǎn)生壓縮，通過(guò)分析施加力與位移間的關(guān)系，可以得到樣品的楊氏模量，其橫向分辨率僅幾個(gè)納米。如今，掃描探針顯微鏡已經(jīng)用來(lái)測(cè)量細(xì)菌[6]、關(guān)節(jié)軟骨[7]、骨組織[8]的彈性，也用來(lái)測(cè)量單個(gè)分子間的結(jié)合力[9]。

本文推導(dǎo)了探針表面施加力、探針縱向位移與細(xì)胞楊氏模量間的關(guān)系。測(cè)量了正常內(nèi)皮細(xì)胞及使用過(guò)氧化氫處理過(guò)的內(nèi)皮細(xì)胞的表面彈性模量。并分析了誤差的來(lái)源。

1 理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)方法

1.1 理論計(jì)算方法

對(duì)于針尖與試樣間的相互作用，其等效楊氏模量可以表示為

式中：和分別是材料的楊氏模量和泊松比，下標(biāo)代表是探針壓頭，代表試樣。這樣由實(shí)驗(yàn)測(cè)得的減去來(lái)確定探針壓頭的。如果已知探針材料的彈性參數(shù)，也可通過(guò)比較理論與實(shí)驗(yàn)測(cè)定的來(lái)驗(yàn)證相應(yīng)的赫茲模型理論。

假設(shè)樣品在探針壓痕處平整且與界面間無(wú)摩擦力，則其正應(yīng)力符合赫茲接觸模型，其邊界條件可寫(xiě)為

在方程(2)中,

正位移u(0，0) 即壓痕深度可表示為[10]

(4)

如果假設(shè)壓痕深度與接觸半徑之間的關(guān)系為[11]

則可以得到力與等效楊氏模量間的關(guān)系:

(6)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

試樣為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，掃描方式為接觸模式。掃描探針顯微鏡工作示意圖如圖1所示。通過(guò)下壓或抬針過(guò)程，可得到下針位移以及由光探測(cè)器得到探針偏轉(zhuǎn)量的關(guān)系。其中偏轉(zhuǎn)量為探針受力的反饋，將兩者轉(zhuǎn)換為壓痕深度與探針受力的關(guān)系即為力曲線(xiàn)。隨后代入公式(6)，計(jì)算可得到等效楊氏模量。

2 結(jié)果與討論

探針彈性由原子力顯微鏡的熱調(diào)諧功能測(cè)得為0.14 N/m。假設(shè)探針針頭半徑為10 nm，細(xì)胞楊氏模量為0.47。得到曲線(xiàn)如圖2所示。圖2中，橫軸為軸位移，縱軸為偏轉(zhuǎn)量。虛線(xiàn)為進(jìn)針曲線(xiàn)，實(shí)線(xiàn)為退針曲線(xiàn)。在非接觸區(qū)域，隨著軸位置的增加，偏移量幾乎不變，表明探針沒(méi)有受到力的作用。隨后探針接觸到細(xì)胞，受到細(xì)胞的彈性力作用，探針產(chǎn)生偏轉(zhuǎn)。在退針時(shí)，在接觸區(qū)域，退針與進(jìn)針曲線(xiàn)幾乎重合。當(dāng)探針退出與試樣接觸區(qū)域時(shí)，由于粘滯力的存在，使探針產(chǎn)生負(fù)向偏移，隨后才進(jìn)入非接觸區(qū)。

如果將接觸區(qū)與非接觸區(qū)的交界取為新的零點(diǎn)，則可將橫軸轉(zhuǎn)變?yōu)閴汉凵疃龋瑫r(shí)縱軸反應(yīng)的是受力后的偏轉(zhuǎn)量，與相乘即為探針受力。由這兩個(gè)參數(shù)通過(guò)公式(6)可得到等效楊氏模量。

2.1 正常內(nèi)皮細(xì)胞的楊氏模量

正常內(nèi)皮細(xì)胞楊氏模量如圖3所示。其中橫軸代表單個(gè)細(xì)胞同一部位不同深度上的采樣點(diǎn)，縱軸代表?xiàng)钍夏Ａ浚煌伾聿煌?xì)胞不同部位。由于細(xì)胞各點(diǎn)處高度不同，而有效數(shù)據(jù)在探針接觸到細(xì)胞后產(chǎn)生，因此采樣點(diǎn)長(zhǎng)度略不同。從圖3中發(fā)現(xiàn)，在剛進(jìn)入細(xì)胞時(shí)，采樣點(diǎn)計(jì)算得到的楊氏模量較大，這主要是因?yàn)樵趬汉凵疃容^小時(shí)，近場(chǎng)引力及靜電力對(duì)探針的影響。另一方面也可能是由于在計(jì)算中較小時(shí)絕對(duì)誤差較大造成的。因此在實(shí)際計(jì)算時(shí)，我們忽略剛進(jìn)入細(xì)胞段的數(shù)據(jù)，只取相對(duì)穩(wěn)定區(qū)域的楊氏模量作計(jì)算。

對(duì)平穩(wěn)區(qū)域的數(shù)值進(jìn)行平均，得到正常內(nèi)皮細(xì)胞的楊氏模量為(0.84±0.14)×105Pa。

2.2 過(guò)氧化氫處理后細(xì)胞的楊氏模量

由于過(guò)氧化氫生成的自由基，與生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸、生物膜上不飽和脂肪酸等發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致大分子變性、脂質(zhì)過(guò)氧化、生物膜損傷等[12]。高濃度>300 μmol/L的過(guò)氧化氫會(huì)迅速導(dǎo)致細(xì)胞不可逆損傷甚至死亡，低濃度過(guò)氧化氫能通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)各種信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，造成對(duì)細(xì)胞的損傷，但其機(jī)制比較復(fù)雜[13]。

分別用100 μmol/L和200 μmol/L過(guò)氧化氫對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行處理。得到楊氏模量分布如圖4和5所示。對(duì)用100 μmol/L和200 μmol/L過(guò)氧化氫處理過(guò)的內(nèi)皮細(xì)胞，計(jì)算得到其楊氏模量分別為(5.47±1.02)×105Pa和(4.02±0.75)×105Pa。與未處理過(guò)的內(nèi)皮細(xì)胞相比，其楊氏模量增加約5倍。因此，處理過(guò)的細(xì)胞更硬且不易形變。這可能是由于該濃度的過(guò)氧化氫可使細(xì)胞功能損傷。內(nèi)皮細(xì)胞楊氏模量的增加可能與內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙有關(guān)，內(nèi)皮細(xì)胞變硬可能是細(xì)胞衰老的一個(gè)標(biāo)志，而楊氏模量可能成為簡(jiǎn)單的內(nèi)皮細(xì)胞功能評(píng)價(jià)指標(biāo)。

從結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)及計(jì)算過(guò)程中存在誤差，誤差可能來(lái)源于以下幾個(gè)方面：

(1) 細(xì)胞培養(yǎng)在蓋玻片上，當(dāng)探針下壓細(xì)胞時(shí)，壓痕深度與細(xì)胞本身的高度大致相當(dāng)，此時(shí)細(xì)胞下方的蓋玻片相當(dāng)于剛性界面，使得在相同載荷力的作用下，探針的壓痕深度變淺，因此會(huì)影響到楊氏模量的計(jì)算，更嚴(yán)格的計(jì)算將在以后的工作中進(jìn)行探討。

(2) 細(xì)胞是非常柔軟的物質(zhì)，細(xì)胞壓痕主要是細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架彈性的反映。因此，過(guò)氧化氫對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響很可能是由于過(guò)氧化氫使得細(xì)胞骨架構(gòu)型發(fā)生改變。而力曲線(xiàn)也依賴(lài)于測(cè)量細(xì)胞的部位，比如當(dāng)壓痕在細(xì)胞核及細(xì)胞核仁上進(jìn)行時(shí)，反映的楊氏模量應(yīng)當(dāng)偏大，而對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行測(cè)量時(shí)，其值相對(duì)較小。因此，需要在先得到細(xì)胞形貌的情況下才能使每次測(cè)量的細(xì)胞位置相同，但是在液相下得到細(xì)胞形貌現(xiàn)在仍然是難題，這將在以后的課題中進(jìn)行研究。

(3) 在計(jì)算中，我們假設(shè)探針針尖的半徑為10 nm。而實(shí)際情況下，該半徑為標(biāo)稱(chēng)值，與實(shí)際探針半徑大小存在偏差，這樣的偏差將導(dǎo)致計(jì)算得到的楊氏模量與實(shí)際細(xì)胞的楊氏模量有所差別。

(4) 實(shí)際細(xì)胞的泊松比很難測(cè)量。一般細(xì)胞的泊松比在0.45~0.49之間。統(tǒng)一假設(shè)其值為0.47，實(shí)際泊松比可能與假設(shè)存在差別。當(dāng)然，對(duì)于同種細(xì)胞，我們認(rèn)為其泊松比的變化量不會(huì)太大。

3 結(jié)論

本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)及計(jì)算得到了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的楊氏模量，發(fā)現(xiàn)用過(guò)氧化氫處理的內(nèi)皮細(xì)胞其彈性要高于未經(jīng)處理的，并分析了誤差的來(lái)源。為將細(xì)胞彈性作為評(píng)價(jià)細(xì)胞功能的手段提供了依據(jù)。

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Elasticity measurement of endothelial cells by scanning probe microscopy

XU Zheng1, DUAN Jun-Li2, QIAN Meng-Lu1, CHENG Qian1

(1. School of Physics Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092,China;2. Department of Gerontology, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200092,China)

It is known that the function of endothelial cells is associated with the presence of many diseases. However, so far the quantitativedescriptions of their function have been seldom investigated. In this paper, the function of endothelial cells is evaluated by the elastic modulus. The theoretical calculation for detecting their Young’s modulus based on indentation theory is established. The Young’s moduli of the normal endothelial cells and the endothelial cells after hydrogen peroxide treatment are investigated by the scanning probe microscopy. It is found that after hydrogen peroxide treatmentthe Young’s modulus of the endothelial cells will be increased. Thus, it is proved that the activity of the cell can be characterized by its elasticity. Finally, errors in the measurement are discussed.

endothelial cells; scanning probe microscope; Young’s modulus; activity

Q2-33

A

1000-3630(2016)-03-0239-04

10.16300/j.cnki.1000-3630.2016.03.011

2016-01-10;

2016-03-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(11404245,11174223, 11374231)

徐崢(1984－), 男, 江蘇蘇州人, 博士, 研究方向?yàn)樯镝t(yī)學(xué)超聲。

程茜, E-mail: q.cheng@tongji.edu.cn