GST-SUMO-MT融合蛋白在大腸桿菌中的自誘導表達

彭冬 楊威 王昭 王席 柳忠玉

（長江大學生命科學學院，荊州 434025）

GST-SUMO-MT融合蛋白在大腸桿菌中的自誘導表達

彭冬 楊威 王昭 王席 柳忠玉

（長江大學生命科學學院，荊州 434025）

旨在考察在大腸桿菌中自誘導表達GST-SUMO-MT融合蛋白的可行性，并對自誘導培養條件及培養基成分進行優化，以提高蛋白產量。采用搖瓶培養，利用單因素和正交實驗對工程菌自誘導的培養條件（誘導時間、誘導溫度）和培養基組分（蛋白胨、酵母粉、甘油、葡萄糖、乳糖）進行優化，檢測菌體濃度、可溶性目的蛋白的表達量。結果表明，自誘導培養基碳氮源的最優配比為：2% 蛋白胨、2% 酵母粉、0.3% 甘油、0.05% 葡萄糖和0.3% 乳糖。重組菌自誘導表達最優發酵條件為：采用兩階段溫度控制，37℃培養3 h，25℃繼續培養 13 h。此時可溶性目的蛋白的表達量和菌體濃度分別為 LB 培養基（IPTG 誘導）的 2.2倍和2.3倍。

金屬硫蛋白；融合蛋白；可溶性表達；自誘導

金屬硫蛋白（Metallothionein，MT）是一類普遍存在于生物體內的富含半胱氨酸、相對分子質量較低的金屬結合蛋白，具有高誘導特性和多種生物學功能。目前比較明確的是MT具有清除體內自由基、參與體內微量元素代謝、解除重金屬的毒性、增強機體各種不良狀態的適應能力、調控機體生長發育和細胞代謝等功能，MT還參與纖維化疾病、神經退行性疾病及腫瘤的發生發展［1］。采用基因工程方法規模化生產制備金屬硫蛋白，對其應用開發和作用機理的研究具有重要的意義。目前，不同來源MT基因先后被克隆入不同的表達載體，在大腸桿菌中進行表達［2-4］。在原核表達體系中常常采用IPTG作為誘導劑。但是IPTG應用于大規模生產基因工程藥物有一定的局限性，例如易形成包涵體、對于人體具有潛在的毒性、價格貴成本高。2005年Studier等［5］提出了外源基因表達自誘導的方法，自誘導培養基中的乳糖是一種二糖，無毒且價格低廉。國內外研究者發現乳糖作為誘導劑表達大腸桿菌重組產物具有明顯的優越性，可溶性表達高，蛋白產量高，成本低等［6-8］。本實驗室前期為了在大腸桿菌中融合表達人金屬硫蛋白MT-1A，以GST為表達標簽和SUMO為分子伴侶，構建了融合蛋白表達載體pET20b-GSMT，并表達成功，但目的蛋白多以包涵體的形式表達。本研究擬考察在大腸桿菌中自誘導表達GST-SUMO-MT融合蛋白的可行性，通過優化自誘導培養基的碳氮源組分及調整乳糖濃度，篩選能高效可溶表達GST-SUMO-MT蛋白的工藝條件，旨為進一步的研究及工業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 表達融合蛋白GST-SUMO-MT的重組基因工程菌pET20b-GSMT/BL21（DE3）由暨南大學醫藥生物技術研究開發中心黃亞東教授惠贈。蛋白質分子量標準和 IPTG 均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 培養基 ZYM-5052 培 養 基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，25 mmol/L Na2HPO4，25 mmol/L KH2PO4，50 mmol/L NH4Cl，5 mmol/L Na2SO4，2 mmol/L MgSO4，0.5%甘油，0.05%葡萄糖，0.2%乳糖。LB培養基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，1% NaCl。

1.2 方法

1.2.1 菌體生長曲線 挑取含有重組質粒pET20b-GSMT的單菌落接種到5 mL LB培養基的試管中，在37℃、200 r/min條件下培養14 h作為種子。按1∶100接種到搖瓶中，分別加入新鮮 LB 培養基、ZYM-5052 自誘導培養基，在 37℃條件下培養24 h。其中LB 菌體培養至 3 h 后，菌體 OD600值達到0.5，加入終濃度 0.5 mmol/L 的 IPTG進行誘導。檢測不同培養時間菌體OD600值，繪制生長曲線。

1.2.2 目的蛋白的可溶性考察 培養結束后收集菌體，加入菌液體積1/20的 PBS懸浮菌體，冰上超聲裂解，12 000×g 離心10 min，分別收集上清和沉淀，進行12% SDS-PAGE電泳。經凝膠光密度掃描分析可溶性蛋白表達含量。相對產量（%）=OD600×可溶性蛋白表達量×100%。

1.2.3 誘導溫度的優化 以 1%的接種量接種到ZYM-5052培養基，首先在37℃培養3 h后，再分別在30、25和20℃繼續培養。選取在ZYM-5052培養基中 37℃恒溫培養 20 h作為對照。發酵結束時測定菌體密度和可溶性蛋白的表達量，并計算相對產量。

1.2.4 誘導時間的優化 利用兩階段溫度進行發酵，37℃培養3 h，然后降溫至25℃繼續培養，分別在降溫后1、5、9、13和17 h取樣檢測菌體密度和可溶性表達量，并計算相對產量。

1.2.5 正交實驗設計 選取蛋白胨、酵母粉、甘油、葡萄糖4 個因素，每個因素選取 4 個水平，采用正交表 L16（45）進行實驗設計的優選。

1.2.6 乳糖濃度的優化 培養物以1% 的接種量分別接種于乳糖含量為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%的優化后的培養基中，37℃培養 3 h，降溫至25℃再培養 13 h。培養結束后分別測定工程菌的菌體密度及可溶性蛋白的含量。本研究中每1組實驗均重復3次，數據用SPSS19 進行統計分析，并用EXCEL繪制圖表。

2 結果

2.1 菌體生長曲線

用ZYM-5052 自誘導培養基對重組基因工程菌pET20b-GSMT/BL21（DE3）進行自誘導發酵，37℃恒溫培養 24 h。選取IPTG誘導的LB培養基作為對照。結果（圖1和圖2）顯示，在IPTG誘導的LB培養基中，菌體在 0-6 h 內菌體密度呈對數增長，10 h后菌體密度不再增加，發酵終點菌體OD600為2.21，可溶性蛋白表達量為 9.2%。自誘導培養基在0-6 h內菌體密度呈對數增長，10 h后菌體密度繼續緩慢增長，發酵終點菌體OD600為2.78，可溶性蛋白表達量為10.21%。結果表明，同LB培養基相比，ZYM-5052培養基更合適菌體密度的提高和可溶性蛋白表達。

2.2 誘導溫度對發酵的影響

對基因工程菌在ZYM-5052自誘導培養基中的發酵條件進行優化。以 1%的接種量接種到ZYM-5052培養基，首先在37℃培養 3 h 后，再分別在30、25和20℃繼續培養。選取在ZYM-5052培養基中37℃恒溫培養20 h作為對照。SDS-PAGE 電泳（圖3）顯示，自誘導后的重組菌可見相對分子質量約45 kD 的特異蛋白條帶，與GST-SUMO-MT融合蛋白理論值相符；37℃恒溫培養時，大部分目的蛋白在沉淀中以包涵體的形式存在，而兩階段培養時，大部分目的蛋白可溶性地存在于離心后的上清溶液中。隨著溫度的降低可溶性蛋白表達量明顯提高，GST-SUMO-MT的相對產量在25℃時為最大值，此時的菌體OD600為2.38，可溶性蛋白表達量為18.3%（圖4）。結果表明，同37℃恒溫發酵相比，兩階段溫度發酵的可溶性表達量大幅度提升，后續實驗選擇利用兩階段溫度控制進行發酵，培養條件為37℃培養3 h，25℃繼續培養。

圖1 pET20b-GSMT/BL21（DE3）工程菌生長曲線

圖2 不同培養基對工程菌密度和可溶性表達量的影響

圖3 不同溫度誘導對可溶性表達的影響

圖4 不同溫度對工程菌密度和可溶性表達量的影響

2.3 誘導時間對發酵的影響

利用兩階段溫度進行發酵，37℃培養3 h，然后降溫至25℃繼續培養，分別在降溫后1、5、9、13和17 h取樣檢測菌體密度和可溶性表達量。誘導不同時間后GST-SUMO-MT 的 SDS-PAGE 電泳和表達量分析結果（圖5和圖6）顯示，隨著時間的延長菌體密度逐漸增大，降溫后5-13 h 內可溶性表達量急劇升高，13 h之后表達量不再明顯增加。GSTSUMO-MT的相對產量在13 h已達最大值，13 h以后變化不明顯。因此確定發酵條件為 37℃培養3 h，降溫至25℃后繼續培養 13 h。

2.4 正交實驗優化培養基

采用L16（45）正交實驗對培養基的碳氮比進行優化，對蛋白胨、酵母提取物、甘油及葡萄糖進行4 因素 4 水平的正交實驗；考察培養基碳源、氮源組分對菌體生長及表達的綜合影響，選取最優的培養基配方。正交實驗因素水平見表 1，實驗結果和極差分析實驗因素對指標的影響結果見表 2。結果表明，培養基對相對產量的影響順序為 B＞C＞D＞A，最終確定優化培養基的組分為A4B4C1D2，即 2% 蛋白胨、2% 酵母粉、0.3% 甘油、0.05%葡萄糖。在此配比下，菌體OD600達到4.26，可溶性表達量為19.81%。

圖5 誘導時間對可溶性表達的影響

圖6 誘導時間對工程菌密度和可溶性表達量的影響

表1 優化培養基碳氮比實驗的因素水平設計

2.5 乳糖濃度對發酵的影響

在優化培養基的碳氮比的基礎上，設置乳糖終濃度分別為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%，37℃培養 3 h，降溫至 25℃再培養 13 h。圖7顯示，菌株在乳糖0.2%-0.4%時維持較高的可溶性表達，乳糖超過 0.6% 時表達量急劇下降。圖8顯示，乳糖在0.2%-0.4%對菌體的生長有一定的促進作用，超過0.6%時菌體密度也明顯下降，GST-SUMO-MT的相對產量在乳糖為 0.3% 時達最大值，此時的菌體OD600為4.94，可溶性蛋白的表達量為19.81%。綜合考慮可溶性表達量和菌體密度因素，工程菌表達的最適乳糖的誘導濃度為0.3%。

2.6 重組基因工程菌在3種培養基中的發酵情況的比較

用優化后的 ZYM-5052 自誘導培養基對重組基因工程菌進行自誘導發酵，并以 IPTG誘導的 LB 培養基、文獻［5］給出ZYM-5052自誘導培養基為對照進行比較。結果（表 3）顯示，優化后的自誘導培養基的發酵產量最高，其可溶性蛋白表達量和菌體濃度分別為 LB 培養基（IPTG 誘導）的2.2倍和2.3倍。

3 討論

自誘導培養基已經成功應用于多種酶和蛋白的高效表達［9-11］。本課題組前期構建了基因工程菌pET20b-GSMT/BL21（DE3），但是目的蛋白GSTSUMO-MT在LB培養基（IPTG誘導）中以包涵體的形式表達，為解決包涵體問題，本實驗研究了在ZYM-5052 培養基中自誘導表達GST-SUMO-MT融合蛋白的可行性。

通過對溫度優化，本實驗選擇利用兩階段溫度控制進行發酵，采用變溫培養模式較單一溫度培養模式，可溶性蛋白表達量有明顯提高。這主要是由于先在 37℃下培養增加菌體量，然后低溫培養減緩重組蛋白的合成速率以促進蛋白正確折疊，這種兩階段溫度調控策略有助于提高蛋白的可溶性表達［12，13］。張芙華等［13］提出利用枯草芽胞桿菌（Bucillis subtilis）分批發酵生產角質酶的兩階段溫度控制策略，即0-4 h時發酵溫度為37℃，4 h后將溫度設置為30℃，采用該策略最高酶活比37℃恒溫培養提高了83.4%。楊鑫等［14］提出了利用灰產色鏈霉菌發酵生產海藻糖合成酶的兩階段溫度控制策略，即37℃培養2.5 h，25℃繼續培養14 h，結果顯示與37℃恒溫培養相比酶活提高了 55.25%。前人的研究為本實驗中兩階段溫度控制策略的制定提供了依據。在本研究中37℃培養3 h時OD600為0.7，菌體已經進入對數生長期，可以進行蛋白的誘導表達。通過誘導溫度和誘導時間的優化，本研究確定了兩階段溫度控制策略，即37℃培養3 h，降溫至25℃繼續培養13 h。

表2 優化培養基碳氮比對工程菌生長及表達的影響

圖7 乳糖濃度對可溶性表達的影響

圖8 乳糖濃度對工程菌密度和可溶性表達量的影響

通常使用的LB培養基組成成分簡單，不能滿足高密度發酵對營養的要求，本研究通過正交實驗對ZYM-5052 自誘導培養基碳氮源的主要成分進行了適當優化，對其含量進行適當的提高，大大提高了該菌株的發酵密度。IPTG的誘導極易形成包涵體，并且對細胞生長有抑制作用，導致細胞不能高密度生長［15］。本研究優化后的自誘導培養基的發酵產量最高，其可溶性蛋白表達量和菌體濃度分別為LB 培養基（IPTG 誘導）的2.2倍和 2.3倍。這主要是由于乳糖可以作為細胞生長的能源，促進細胞高密度生長，同時可以作為誘導劑，從而提高細胞活性和蛋白表達量，與傳統培養基相比可以使菌體密度和可溶性蛋白表達量增加數倍［16］。但本研究中當乳糖濃度過高（0.6%）時產生抑制效應，與文獻報道類似［17］。乳糖自誘導表達系統既保證了乳糖誘導蛋白表達的穩定性，同時自誘導發酵過程中無需檢測菌體的生長狀態，避免了不必要的污染，并且節省成本［18］。

表3 培養基優化前后培養工程菌效果的比較

4 結論

經過優化得出最優培養基成分為：2% 蛋白胨、2% 酵母、0.3% 甘油、0.05%葡萄糖、0.3%乳糖。在37℃培養 3 h，降溫至 25℃再培養 13 h。優化后的自誘導培養基的發酵產量大幅度提高，其可溶性蛋白表達量和菌體濃度分別為 LB 培養基（IPTG 誘導）的2.2倍和 2.3倍。本研究通過對培養基的調整和發酵工藝的優化，降低了生產成本。

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（責任編輯 馬鑫）

Auto-inducing Expression of GST-SUMO-MT Fusion Protein in Escherichia coli

PENG Dong YANG Wei WANG Zhao WANG Xi LIU Zhong-yu
（College of Life Sciences，Yangtze University，Jingzhou 434025）

The auto-inducing expression of GST-SUMO-MT fusion protein in Escherichia coli BL21（DE3）was studied. In order to increase the protein yield， we optimized both the auto-induction fermentation conditions and medium. Recombinant E. coli was cultured in shake flask， of which the culture condition（time and temperature for induction）and medium composition（tryptone， yeast extract， glycerol， glucose and lactose）were optimized by single factor and orthogonal tests， and bacterial concentration， expression level of soluble target protein were determined. Result showed that the optimal carbon and nitrogen composition ratio in auto induction medium was obtained as followed：2% tryptone， 2% yeast extract， 0.3% glycerol， 0.05% glucose， 0.3% lactose. The optimum fermentation conditions were：cultivating in 37℃ for 3 h firstly， then culturing in 25℃ for 13 h. Under the optimal condition， the expression level of soluble target protein and bacterial concentration were 2.2 and 2.3 times of those in LB medium under induction of IPTG respectively.

metallothionein；fusion protein；soluble expression；auto-induction

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.030

2015-08-31

長江大學大學生創新創業訓練計劃項目（104892013034），長江大學博士啟動基金項目（801100010122）

彭冬，男，研究方向：生物工程；E-mail：1182359426@qq.com

柳忠玉，女，博士，講師，研究方向：生物制藥；E-mail：zyliu2004@126.com