耐二氧化硫乳酸菌的篩選鑒定及其在泡野山椒中的應用

胡露，胡凱弟，王興潔，雷承延，周康,2，陳安均，劉書亮,2*

1 (四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014)2 (四川農業大學 食品加工與安全研究所，四川 雅安，625014)

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耐二氧化硫乳酸菌的篩選鑒定及其在泡野山椒中的應用

胡露1，胡凱弟1，王興潔1，雷承延1，周康1,2，陳安均1，劉書亮1,2*

1 (四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014)2 (四川農業大學 食品加工與安全研究所，四川 雅安，625014)

篩選出2株源于泡蒜的耐SO2乳酸菌，對其形態學觀察、生理生化測試及16S rDNA序列測定，菌株2-2被鑒定為發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)，菌株2-5為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。利用2株菌耐SO2特性，將其應用于野山椒泡制中，對含SO2的泡野山椒基礎配方進行優化，結果表明：2株菌均在含SO2150 mg/L的MRS培養基中能正常生長；將2菌株按1∶1的比例混合，以2%(v/w)的接種量接種至含SO275 mg/L，鹽含量4%，蔗糖含量2%的野山椒中，室溫發酵，成熟的泡野山椒酸咸適宜，色澤金黃、味道鮮美，具有泡野山椒典型的香氣，為其工業生產提供了數據參考。

耐SO2；乳酸菌；泡野山椒；發酵

野山椒(Capsicumfrutescensvar)俗稱天椒、小米辣，果實呈米粒形或短指形，果皮主要為淡黃色、綠色，辣味濃郁[1]。野山椒經泡制發酵后，具有脆嫩芳香，辣中帶酸、辣而不燥的特點，可增食欲、助消化、具有營養保健[2]的功效。泡野山椒的傳統制作多以添加有機酸和SO2的化學法進行。對野山椒的護色需要添加一定量的SO2，SO2可殺死不耐受SO2的乳酸菌及其他微生物。也有采用自然發酵法，其發酵周期緩慢，甚至雜菌污染而發生“生花”、變軟、褐變等現象，產品質量不穩定[3]。乳酸菌作為泡菜發酵的主要菌群，其具有發酵糖產酸，降低環境pH值，改善泡菜風味等功能[4]。隨著泡菜工業化的發展，人工接種乳酸菌已成為現代發酵工業的新趨勢。而目前關于利用乳酸菌發酵泡野山椒以改善泡椒品質的研究還鮮有報道。

有研究表明：泡菜色澤變化的主要原因有酶促褐變、維生素C氧化以及雜菌生長引起的變色等[5]。野山椒中Vc含量高，在發酵過程中易被氧化而引起變暗或變黑的現象[6]，嚴重影響產品外觀、風味、營養價值，甚至商品價值。護色與防腐成為泡野山椒加工的一個關鍵環節。由于亞硫酸鹽離子的親核反應性，使其具有能廣泛抑制褐變的功能[7]，對食品能夠起到漂白、抑菌[8]、脫色和抗氧化[9]的作用。在泡野山椒生產中添加SO2或亞硫酸鹽，對泡野山椒可以起到很好的護色作用，防止其褐變，使用低濃度的SO2不僅能達到理想效果減少殘留，且能降低生產成本[10]。而SO2的抑殺菌作用會對泡野山椒中乳酸菌的生長發酵產生抑制效果，實際生產中往往出現泡野山椒自然發酵失敗或為了防腐出現SO2殘留超標的現象。為了能使泡野山椒產生良好的風味與色澤，采用接種耐受SO2的乳酸菌和添加SO2產生協同效應，因此，本試驗以篩出耐SO2乳酸菌并將其應用于發酵野山椒中，優化泡野山椒的基礎配方，為泡野山椒的工業化生產提供數據參考。

1　材料與方法

1.1原料

野山椒購自四川省雅安市蒼坪路農貿市場；食鹽、蔗糖均為食品級，購自雅安市吉選超市。

1.2菌株

乳酸菌株2-2和2-5分離于泡蒜；菌株8m-9(植物乳桿菌，Lactobacillusplantarum)、3m-1(腸膜明串珠菌，Leuconostocmesenteroides)分離于什錦泡菜[11]；菌株6066分離于葡萄酒，為酒明串珠菌(Leuconostocoenos)。由四川農業大學食品微生物實驗室提供。

1.3培養基

MRS培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸餾水1 000 mL。pH 6.0～6.4，121 ℃滅菌15 min。

1.4試劑

焦亞硫酸鈉為食品級，市售。鹽酸、乙酸鉛、淀粉指示液、碘標準溶液、氫氧化鈉標準滴定溶液、酚酞指示劑；乳酸菌生化鑒定管，青島海博生物技術有限公司；溶菌酶(10 mg/mL)，北京天為時代科技有限公司；Taq酶、PCR反應試劑，寶生物工程(大連)有限公司；TIANGEN試劑盒(TIANamp Bacteria DNAkit 細菌基因組DNA提取試劑盒-離心柱型)，天根科技生化(北京)有限公司。

1.5主要儀器

DHG-9162電熱恒溫培養箱，上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1F潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；SorvallST16R高速冷凍離心機，美國Thermo Fisher Scientific公司；PTC-200 PCR儀，美國Bio-Rad公司；CX21FS1光學顯微鏡，日本Olympus公司；pHS-4C+數顯酸度計,成都世紀方舟科技有限公司；G154DW全自動高壓滅菌鍋，致微儀器有限公司。

1.6方法

1.6.1耐SO2乳酸菌的篩選

將4 ℃冰箱保存的斜面乳酸菌菌種，接種到MRS培養基活化培養后，以1%的接種量接種菌濃度為107CFU/mL的菌液到SO2含量分別為0、50、100、150、200 mg/L的MRS培養基中，設定初始pH為5.5，37 ℃培養2 d，采用GB 4789.35—2010測定乳酸菌數,判斷菌株耐受SO2的能力。

1.6.2耐SO2乳酸菌的鑒定

1.6.2.1菌株形態及生理生化鑒定

在形態特征觀察的基礎上，參照《乳酸菌鑒定及實驗方法》和《伯杰氏系統細菌鑒定手冊》，選擇青島海博生物技術有限公司的乳桿菌成套生化試劑進行鑒定。

1.6.2.216S rDNA的分子生物學鑒定

①將菌種接于10 mL MRS液體培養基，37 ℃靜置培養24 h，收獲菌體。按Bacterial DNAout抽提試劑盒使用手冊提取菌株2-2、2-5的總DNA。

②16S rDNA的PCR擴增和序列測定：16S rDNA的通用引物為27F、1492R。PCR反應體系(25 μL)為：上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，模板DNA 1 μL，2×longTaqPCR MasterMix 12.5 μL(包括：0.1 U longTaqpolymerase/μL，500 μmol/L dNTP each，20 mmol/L pH 8.3 Tris-HCl，3 mmol/L MgCl2)，超純水9.5 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃ 1 min，66 ℃ 1 min，72 ℃20 s，循環30次；72 ℃延伸10 min。PCR產物由上海英濰捷基生物技術有限公司進行序列測定。

③序列分析：PCR產物序列通過BLAST在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB基因庫中進行同源性比較和系統發育樹構建[12]。

1.6.3泡野山椒工藝配方優化

菌懸液、焦亞硫酸鈉、食鹽、蔗糖

↓

新鮮野山椒→去梗→清洗→瀝干→裝罐→密封→發酵

原料處理：選擇大小均勻、淡黃色且新鮮的野山椒，剔除色深、已腐爛個體，去梗，清水清洗并瀝干。

裝罐：將冷開水注入罐中，加入焦亞硫酸鈉溶液、食鹽、蔗糖充分攪拌溶解后，并接種乳酸菌，按1∶1(w/v)的菜水比例，將野山椒碼放于罐中，使其完全浸沒于鹽水中。

密封：蓋好罐蓋，避免空氣及雜菌進入(以pH值降為3.5～3.6為發酵終點)。

1.6.3.1發酵野山椒

在室溫(日均最高、最低氣溫為25 ℃、15 ℃)下，選取接種混合乳酸菌(A：將篩選的耐SO2乳酸菌2-2∶2-5以1∶1混合接種)、焦亞硫酸鈉(B)、食鹽(C)、蔗糖(D)作為基礎配方成分,參照文獻[13]并在實驗室研究基礎之上設計4因素3水平正交試驗，試驗因素表見表1，以感官評分和總酸為評價指標，優化泡野山椒基礎工藝配方。

表1　L9(34)正交試驗因素水平表

1.6.3.2檢測指標

(1)總酸測定：根據GB/T12456—2008《食品中總酸的測定》中的規定，采用酸堿滴定法，以乳酸計。

(2)SO2殘留測定L按照GB/T 5009.34—2003進行，采用直接滴定碘量法。

(3)乳酸菌數測定：平板計數法，參照GB 4789.35—2010測定。

(4)感官評價：參照文獻[14]中發酵辣椒感官評分標準略改動，10人評價小組對產品的色澤、香氣、滋味、質地進行感官評價，對應的評價得分集=[很差(2)，較差(4)，一般(6)，較好(8)，很好(10)]，評價結果用SPSS.19軟件進行數據分析。

2　結果與分析

2.1菌株耐SO2能力的測定

將5株菌按照2%的接種量接種到初始pH5.5，SO2質量濃度分別為0、50、100、150、200 mg/L的MRS液體培養基中，37 ℃培養48 h，測定菌數，結果見表2。

表2　菌株在不同SO2濃度的發酵液中的生長情況

一般情況下，細菌對SO2很敏感，SO2結合在被細胞膜束縛的ATP酶上，使細胞內ATP的丟失不受控制，從而影響細胞活性[6]，較低濃度的SO2對細菌都有一定的抑制或殺滅作用[15]。由表2可知，菌株6066、8m-9、3m-1的生長繁殖受到SO2的嚴重影響。無添加SO2培養條件下，從培養開始到結束，3株菌的菌量由105CFU/mL上升到1010CFU/mL，而在含SO250 mg/L的低濃度培養基中，培養2 d后的菌量為104或105CFU/mL，與零添加培養比較，說明菌株在接種至含SO2的培養基后沒有繁殖跡象甚至一部分已經死亡。隨著SO2濃度的繼續升高，菌株死亡增加，菌數迅速減少，當SO2濃度達到200 mg/L時，這3株菌活菌數幾乎為零。菌株2-2、2-5雖然隨SO2濃度的升高，菌數逐漸下降，但降幅遠低于其余3株菌。當SO2濃度在50～150 mg/L區間內時，培養2 d后發現2菌株菌濃度均能達到107CFU/mL以上，生長穩定，且在含200 mg/L SO2的培養基中，菌數還能基本維持在初始菌數范圍內，因此認為菌株2-2、2-5為耐SO2的乳酸菌。菌株2-2、2-5均從大蒜泡菜水中篩得，試驗選擇這兩株菌作為后續研究對象。

2.2耐SO2乳酸菌的鑒定結果

菌株2-2、2-5在MRS培養基中培養48 h后的菌落及菌體形態見圖1和圖2。2菌株在改良MRS平板上的菌落形態為圓形、邊緣整齊，表面光滑濕潤，隆起，在含碳酸鈣的MRS平板上均有溶鈣圈，菌株2-5呈乳白色，而菌株2-2為淺白色，菌落較小；革蘭氏染色鏡檢結果均為G+短桿菌。

圖1　乳酸菌菌株2-2的細胞形態及菌落形態Fig.1　Cell morphology and colony morphology of lactic bacteria 2-2

圖2　乳酸菌菌株 2-5的細胞形態及菌落形態Fig.2　Cell morphology and colony morphology of lactic bacteria 2-5

2.2.1生理生化結果

菌株2-2、2-5的生理生化實驗結果見表3，2菌株能發酵分解糖代謝，不還原硝酸鹽，不液化明膠，接觸酶和氧化酶皆呈陰性，結合形態特征和《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》初步判斷菌株2-2和2-5屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)。

2.2.2分子生物學鑒定結果

采用16S rDNA序列同源性分析法對菌株2-2、2-5 進行分子生物學鑒定，以確定其分類地位。分別以2株菌的總DNA為模版，用細菌16S rDNA通用引物進行擴增，將得到的PCR產物送上海英濰捷基公司進行序列測定，2-2、2-5測序片段長分別為1444 bp、1433 bp，具有典型的16S rDNA的特征。將2菌株的16S rDNA序列輸入GenBank，以Blast 軟件進行序列同源性比較，結果顯示：菌株2-2的16S rDNA基因序列與登錄號為JN175331.1、KJ026616.1等發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)有100%相似性，在系統發育樹上處于同一分支。菌株2-5的16S rDNA基因序列與登錄號為KP862657.1、AJ965482.1等植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)相似性達100%。2菌株均與嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactissubsp)近緣乳酸菌親緣關系較遠(圖3)。因此，根據其親緣關系，結合形態、生理生化鑒定結果確定2-2為發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum2-2)，2-5為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum2-5)。

表3　菌株2-2、2-5的生理生化特征

注：“-”為陰性反應，“+”為陽性反應。

2.3泡野山椒基礎工藝配方的確定

由表5和表6結果顯示，影響泡野山椒感官評價的主次順序為A(接種量)>C(食鹽添加量)>D(蔗糖添加量)>B(SO2添加量)，即對泡野山椒感官影響最大的因素為乳酸菌的接種量，SO2添加量對其品質影響最小，最優組合為A3B2C1D3。泡野山椒發酵產酸方面，最佳組合為A3B1C1D3，乳酸菌接種量和蔗糖添加量對泡野山椒產酸的影響較大，食鹽添加量的影響次之，而SO2添加量的影響最小，這4個因素對泡野山椒產酸的影響都未達到顯著水平。綜合考慮各因素指標，選擇最佳發酵條件：為A3B2C1D3，即接種量2%，SO2添加量75 mg/L，鹽含量4%，蔗糖含量2%。

圖3　菌株2-2、2-5基于16S rDNA的系統發育樹Fig.3　Phylogenetic tree of strain 2-2 and 2-5

按照以上所得最優發酵條件進行驗證試驗，結果證明，接種量2%，SO2添加量75 mg/L，鹽含量4%，蔗糖含量2%，在室溫(日均最高、最低氣溫為25 ℃、15 ℃)下發酵5 d后野山椒成熟，其總酸含量為1.05 g/100 mL，乳酸菌數為1.18×108CFU/mL，感官評分為8.86，泡山椒呈淡黃色、色澤鮮亮，口感酸咸適宜，香氣濃厚。測得樣品中SO2含量為11.2 mg/L，符合國家食品安全標準。

表4　正交試驗結果

表5　直觀分析表

表6　方差分析表

注：F0.05(2,9)= 4.26；F0.01(2,9)= 8.02。

3　結論與討論

篩得2株對SO2具有較強耐受能力的乳酸菌，經系統鑒定為發酵乳桿菌2-2(Lactobacillusfermentum2-2)、植物乳桿菌2-5(Lactobacillusplantarum2-5)，它們在SO2添加量為150 mg/L培養基中均能正常生長。菌株2-2和2-5均來源于大蒜泡菜水，在蒜制品生產過程中，為使其保持鮮艷色澤和抑制微生物生長常使用亞硫酸鹽[16],這可能是菌株2-2與2-5較其他來源乳酸菌耐SO2的原因。SO2對乳酸菌有強烈的抑制作用，并且低的pH值與SO2的抑制作用有協同效應，原因是SO2在水溶液中會呈現3種形式：游離態SO2、HSO3-、SO32-，其中游離態的SO2是唯一一種能夠與食品中一些重要的風味及呈色化合物結合的形態[17]，酸性條件下結合態的SO2易轉化成游離態的SO2，從而增大了游離態SO2濃度，對乳酸菌造成毒害影響[18]。泡野山椒是酸性食品，其pH值范圍易以游離態SO2形式的呈現，能起到良好的護色、抗氧化作用。因此，選育出具有抗逆性的耐SO2乳酸菌是改善泡野山椒品質的關鍵。SO2常作為防腐劑、抗氧化劑、抑菌劑廣泛應用于食品行業，尤其是偏酸食品例如醬腌菜、果汁、發酵飲料[19-20]，利用乳酸菌與添加SO2結合來發酵野山椒以改善泡野山椒品質的報道甚少。目前關于耐受SO2乳酸菌的研究主要集中在果酒釀造領域。任香蕓[21]等從加硫枇杷汁自然發酵的枇杷酒中分離篩選得到耐SO2的植物乳桿菌R23，可耐受120 mg/L總SO2及13%酒精。段浩云[22]等分離于自然發酵的葡萄酒中的菌株G23和L42能在酒精度13% vol、130 mg/L SO2的環境下生長，2株菌均為植物乳桿菌。

將菌株2-2、2-5以1∶1的比例混合，按照接種量2%接種，SO2添加量為75 mg/L，食鹽含量4%，蔗糖含量2%在室溫下發酵5 d，得到具有良好風味、金黃色澤的泡野山椒，SO2殘留低于國家安全標準，為泡野山椒生產提供了參考數據。

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Screening, identification of sulfur dioxide-resistant lactic acid bacterium and its application in fermentation of rod chilli

HU Lu1,HU Kai-di1,WANG Xing-jie1,LEI Cheng-yan1,ZHOU Kang1,2,CHEN An-jun1,LIU Shu-liang1,2*

1(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)2(Institute of Food Processing and Safety, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

Two kinds of sulfur dioxide-tolerant lactic acid bacterium were screened from garlic pickled water, and were identified to be asLactobacillusfermentumandLactobacillusplantarumrespectively based on the results of characterization of morphology, physiological and biochemical properties and 16S ribosomal DNA identification. The two strains were applied in fermentation of pickled rod chilli, and the fermentation formula for rod chili containing sulfur dioxide was optimized. Results showed that the two strains could grow well in MRS media containing 150 mg/L SO2. The optimal fermentation formula was as follows: the mixture of strain 2-2 and strain 2-5 with ratio of 1∶1 was inoculated (2%, v/w) into rod chilli sample containing 75 mg/L SO2, 4% of salt, 2% of sucrose, and then fermented at room temperature. By using the optimized fermentation formula based on these two strains, the pickled rod chilli product had golden color, extremely good taste and typical aroma. This work provides a basis for the industrial production of pickled rod chilli.

sulfur dioxide-resistant; lacticacid bacterium; identification;rod chilli;fermentation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609026

碩士研究生(劉書亮教授為通訊作者,E-mail:lsliang￣999@163.com)。

四川省農業科技成果轉化資金項目(14NZ0012)；四川農業大學大學生創新性科研項目

2016-03-21，改回日期：2016-05-24