新疆特色藥食同源植物恰瑪古內生細菌的分離與篩選

趙燃，迪麗達爾·庫德熱提，姚粟，苗蕾，梁寒峭，劉素輝，曹艷花，陳建國，劉洋*，孫玉萍*

1(中國食品發酵工業研究院，中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京，100027)2(新疆醫科大學，基礎醫學院微生物學教研室，新疆 烏魯木齊，830011)3(新疆醫科大學，公共衛生學院，新疆 烏魯木齊，830011)

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新疆特色藥食同源植物恰瑪古內生細菌的分離與篩選

趙燃1，迪麗達爾·庫德熱提2，姚粟1，苗蕾3，梁寒峭1，劉素輝2，曹艷花1，陳建國1，劉洋1*，孫玉萍2*

1(中國食品發酵工業研究院，中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京，100027)2(新疆醫科大學，基礎醫學院微生物學教研室，新疆 烏魯木齊，830011)3(新疆醫科大學，公共衛生學院，新疆 烏魯木齊，830011)

通過傳統微生物培養方法對我國新疆恰瑪古內生細菌進行分離及篩選，共得到48株內生細菌，分為7個OTUs，經形態學觀察、16S rDNA擴增及系統發育分析，將其歸為厚壁菌門(Firmicutes)中的芽胞桿菌屬(Bacillussp.)、放線菌門(Actinobacteria)中的微桿菌屬(Microbacteriumsp.)和變形菌門(Proteobacteria)中的噬脯氨酸菌屬(Prolinoborussp.)。這是國內外首次對我國新疆特有的藥用植物恰瑪古內生細菌進行分離篩選的研究。

新疆恰瑪古；內生細菌；培養方法

植物內生菌是指一類微生物，它們的生活史中部分或全部階段在健康植物中定殖，并且不會對植物的細胞及組織造成危害。植物內生菌定植在宿主植物中，內生菌與其宿主在協同進化的過程中形成了互利共生的關系。內生菌生長所必需的碳源氮源等多種營養物質由宿主植物光合作用來提供；同時，內生菌在生長代謝過程中會產生促進植物生長、抵抗病原菌、提高植物抗逆性，間接起到植物促生作用的活性物質[1]。

非培養方法能夠反映植物內生菌的多樣性及群落分布結構特點，具有客觀、全面等特點[2-3]。然而，培養方法作為傳統的植物內生菌研究手段，也有其特有的優點，它以微生物的純培養法為基礎，對微生物進行分離、篩選和純化，進而對篩選到的菌株進行分類學鑒定，通過該方法能夠了解植物內的可培養微生物的生長情況，尤其是在特定生長條件下的生存狀況，另一方面通過對可培養微生物的分離篩選，可以獲得微生物新種和一些具有潛在應用價值的菌種資源[2]。

恰瑪古(BrassicarapaL.)又名蕪菁或蔓菁，恰瑪古是其維吾爾文名稱，在我國新疆南部地區大面積種植，具有一定藥用作用，尤其是其根部，是新疆維吾爾等少數民族日常喜食的植物[4]。目前關于恰瑪古的研究大多著重于化學成分的角度，對其內生細菌的研究還鮮有報道，本文采用傳統微生物培養方法對恰瑪古內生細菌進行了分離及篩選，為進一步研究其內生細菌與恰瑪古之間的相互作用關系，揭示恰瑪古在長壽作用方面的療效奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1植物樣品

恰瑪古成熟果實，于2015年9月15日采集自中國新疆烏魯木齊市米東區古牧地鎮團結村十一小隊，具體位置為北緯87.69°，東經44.02°，樣品于4 ℃保存。

1.2培養基及試劑

成品培養基LB、R2A及TSA購自北京陸橋公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司；PCR引物由北京諾賽生物公司合成； PCR相關試劑購自TIANGEN公司。

1.3樣品表面滅菌

恰瑪古果實用無菌水將表面泥土清洗干凈，并用無菌水沖洗，采用劉洋等[5]的方法對恰瑪古果實進行表面滅菌；表面滅菌效果檢測方法為取最后一次淋洗水120 μL，涂于LB固體培養基平板上，28 ℃培養72 h，觀察有無菌落形成[5]。用無菌手術刀及鑷子切取5 g已表面滅菌的恰瑪古樣品內部組織塊，置于無菌研缽中。

1.4內生細菌的分離與純化

對恰瑪古內生菌進行分離培養及純化，具體參考劉琳等方法[2]。根據平板上長出的菌落形態(大小、形狀、顏色、透明度、濕潤度、表面光澤度、邊緣整齊度等)，記錄菌落形態的基本特征，同時隨機挑取菌落形態不同的代表性菌落，用對應培養基對其進行分離純化，保證每個菌落為單菌落，再接種于斜面培養基4℃保存備用。

1.5內生細菌的16S rDNA序列分析

采用細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)提取菌株基因組DNA。引物選取細菌通用27F和1492R[6]， 以細菌基因組DNA作為PCR反應的模板，對菌株16S rDNA片段進行PCR擴增。PCR反應條件參見劉洋等方法[5]。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。采用ABI 3730型DNA測序儀測序(ABI，USA)，將序列信息提交至NCBI，并將測序所得結果在EzTaxon server 2.1進行比對[7]，確定得到序列與已知序列的同源關系。

2　結果與分析

2.1恰瑪古種子內生細菌的分離純化

通過傳統微生物分離培養共獲得恰瑪古內生細菌48株，根據這些菌株較為明顯的形態差異分為5類，其菌落及菌體形態特征如表1所示。

表1　恰瑪古內生細菌及其形態特征

2.2恰瑪古內生細菌基因組DNA提取及16S rDNA片段PCR擴增

用細菌基因組DNA提取試劑盒提取恰瑪古內生細菌基因組DNA，并以其為模板，對16S rDNA片段進行PCR擴增， 1%凝膠電泳顯示PCR產物條帶單一且明亮，大小約為1 500 bp(見圖1)。

M-D2000 Marker Ladder; 1-10: 恰瑪古內生細菌16S rDNA片段圖1　恰瑪古內生細菌16S rDNA片段擴增結果Fig.1　The 16S rDNA agarose gel electrophoresis of endogenous bacteria from Turnip

2.3恰瑪古內生細菌16S rDNA系統發育分析

恰瑪古內生細菌的16S rDNA序列比對分析結果如表2所示，所得序列 GenBank登錄號為KT990223- KT990229。經16S rDNA序列比對及其系統發育分析(見圖2)，恰瑪古內生細菌包含7個OTU，分屬厚壁菌門(Firmicutes)中的芽胞桿菌屬(Bacillussp.)、放線菌門(Actinobacteria)中的微桿菌屬(Microbacteriumsp.)和變形菌門(Proteobacteria)中的噬脯氨酸菌屬(Prolinoborussp.)；該群落優勢屬(豐度)為Bacillus(85.4%)(表2)。

3　討論

恰瑪古(BrassicarapaL.)又稱為蕪菁或蔓菁，維吾爾文稱其為恰瑪古，其根常入藥，是新疆地區少數民族喜愛食用的藥食植物[4]。藥典中對恰瑪古的藥理作用有所記載可以追溯到兩千多年前，《本草綱目》等書籍中稱其益中氣、利五臟、解邪毒。近幾年也有學者對恰瑪古的藥理作用有所研究，恰瑪古中多糖提取后對小鼠進行血糖試驗發現當劑量達到400 mg/kg時，受試小鼠血糖下降明顯，這說明恰瑪古具有降糖效果是其中的多糖成分在發揮作用[8]。孫艷等[9]發現恰瑪古制成的蜜膏能夠促進血清中抗體的生成，實驗表明其作為一種免疫促進劑，能夠使小鼠食用后血清中IgM抗體的水平有所提高。還有研究表明恰瑪古硫代葡萄糖苷的含量很高，其降解后的產物能預防多種癌癥發生[10]，恰瑪古根皮中含有蕓苔素成分，可以對某些病原菌及人類寄生蟲產生抑制作用[11]。

本研究自我國特有的新疆藥食植物恰瑪古中分離培養得到48株內生細菌，包含7個OTUs，分屬于芽胞桿菌屬(Bacillussp.)、微桿菌屬(Microbacteriumsp.)和噬脯氨酸菌屬(Prolinoborussp.)，其中優勢菌屬為Bacillus(85.4%)，最優勢菌為蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)，所占比例達到41.8%。芽胞桿菌由于其能夠產生耐極端生境的內生孢子，因此在自然界中分布廣泛。芽胞桿菌中也不乏一些植物促生菌和生防菌，如多粘芽胞桿菌(B.polymyxa)、蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)和枯草芽胞桿菌(B.subtilies)等。芽胞桿菌的生防作用主要通過代謝產物對病原菌起到拮抗作用，例如蠟樣芽胞桿菌代謝產生的酶類物質可以降解或水解其他病原菌，從而起到生防作用[12]。同時，芽胞桿菌也能夠促進植物生長，合成生長素、赤霉素等生長激素，對植物起到促生作用[13]。

表2　恰瑪古內生細菌16S rDNA序列相似性分析

圖2　鄰接法構建的恰瑪古內生細菌16S rDNA序列系統發育樹Fig.2　The phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences from Turnip using the neighbour-joining(注：每個分支點處的數字為Bootstrap(1000次抽樣)的支持百分率，標尺代表1%的序列差異度。)

通過以上研究可見，新疆藥食植物恰瑪古中存在多種細菌資源，內生細菌的群落多樣性較豐富，其中富含一些有益的菌種資源。因此，通過傳統培養方法對恰瑪古內生細菌進行分離和鑒定，能夠篩選出具有生防及植物促生作用的潛在功能性菌株，為深入研究內生菌與恰瑪古植物的藥理作用之間的關系奠定了基礎。

4　結論

本研究是國內外首次針對我國特色新疆藥食植物恰瑪古，利用傳統微生物培養方法分離其內生細菌，內生菌分屬芽胞桿菌屬、微桿菌屬和噬脯氨酸菌屬，其中包含潛在的生防菌及植物促生細菌，本研究為今后進一步開展恰瑪古的藥食作用與其內生細菌之間的相互作用關系奠定了基礎。

致謝:中國食品發酵工業研究院程池教授在本研究工作中提供了指導與幫助，在此特表示感謝。

[1]徐玲玲,單慶紅,斌郭.植物內生菌研究進展及應用展望[J].安徽農業科學,2013, 41(13):5 641-5 643.

[2]劉琳,劉洋,宋未.雜交水稻種子固有細菌群落多樣性探究[J].生物技術通報，2009,25(1):95-99.

[3]劉琳,劉洋,宋未.PCR-DGGE技術及其在植物微生態研究中的應用[J].生物技術通報,2009,25(3): 54-56

[4]王麗萍,王航宇,譚勇,等.維藥恰瑪古的研究進展[J].農墾醫學,2012,34(6): 525-529.

[5]劉洋,左山,鄒媛媛,等.雜交玉米農大108及其親本種子內生細菌群落多樣性的研究[J].中國農業科學,2011,44(23):4 763-4 771.

[6]YANG LIU,LIN LIU,FUBIN QIU,et al.Paenibacillushunanensissp. nov., isolated from rice seeds[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2010,60:1 266-1 270.

[7]CHUN J,LEE J H,JUNG Y,et al.EzTaxon: a web-based tool for the identication of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences[J].Int J Syst Evol Micr,2007,57:2 259-2 261.

[8]艾克拜爾江·阿巴斯,李冠,王靜.新疆蕪菁多糖降血糖作用的研究[J].新疆農業科學,2011,48(3): 471-479

[9]孫艷,安熙強,馬媛,等.恰瑪古蜜膏對小鼠免疫功能的影響[J].中國醫藥報,2010, 7(6):20-22.

[10]KENNEY P M J，HEEHT S S，CANMELLA S G，et al.Quantitation of glucosinolates in vegetabls consu-med in Singapore: Relationship to metabolites of 4-(methyl nitrosa mino) -1-(3-pyridyl) -l-butanone NNK in smokers[J].Proceedings of the American Association for Cancer Research，2004,45:935-944

[11]南京中醫藥大學.中藥大辭典(上冊)[M].上海:上海科學技術出版社,1999:695-697.

[12]AVINASH V S,ATUL K,NAIK N,et al.Characterization of a newBacilluscereusATUAVP1846 strain producing Penicillin V acylase, and optimization of fermentation parameters[J]. Ann Microbiol, 2011,10:219-226.

[13]HAMDACHE A,LAMARTI A,ALEU J,et al.Non-peptide metabolites from the geneBacillus[J].Journal of Natural Products,2011,74(4):893-899.

Separation and screening of endophytic bacteria in Xinjiang Turnip (BrassicarapaL.)

ZHAO Ran1, DILIDAER Kudereti2,YAO Su1, MIAO Lei3, LIANG Han-qiao1,LIU Su-hui2, CAO Yan-hua1, CHEN Jian-guo1, LIU Yang1, SUN Yu-ping2*

1(China Center of Industrial Culture Collection, China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 100027,China)2(College of Basic Medical Science, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China)3(College of Public Health, Xinjiang Medical University,Urumqi 830054, China)

The endophytic bacteria in Xinjiang Turnip were isolated, screened and identified by the microbial culture-dependent method combing with morphological observation, 16S rDNA amplification and phylogenetic analysis. The result showed that the total 48 strains from Turnip were classified into 7 OTUs and belonged toBacillus,MicrobacteriumandProlinoborus. It was the first time that culture-dependent method was used to isolate and identify the endophytic bacteria in Turnip used as medicinal plants in Xinjiang.

Xinjiang Turnip;endophytic bacteria;culture-dependent method

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609022

碩士研究生(劉洋,孫玉萍為通訊作者,E-mail：ly81150@163.com,544481723@qq.com)。

中國食品發酵工業研究院科技發展基金(博士基金)項目(2012KJFZ-BS-01) ；國家自然科學基金(81460153，81560153)；新疆維吾爾自治區自然科學基金(2015211C014)

2016-02-23,改回日期：2016-04-13