線性減小比生長(zhǎng)速率指數(shù)補(bǔ)料策略對(duì)酵母生產(chǎn)效率的改善

季萌，繆冶煉*，陳介余，尤業(yè)兵，劉飛龍，許琳

1(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京，211800)2(日本秋田縣立大學(xué) 生物資源學(xué)部，日本 秋田，010-0195)3(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京，211800)

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線性減小比生長(zhǎng)速率指數(shù)補(bǔ)料策略對(duì)酵母生產(chǎn)效率的改善

季萌1，繆冶煉1*，陳介余2，尤業(yè)兵1，劉飛龍1，許琳3

1(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京，211800)2(日本秋田縣立大學(xué) 生物資源學(xué)部，日本 秋田，010-0195)3(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京，211800)

酵母的生產(chǎn)效率和成本在很大程度上依賴于培養(yǎng)模式。根據(jù)酵母的生長(zhǎng)特性，提出了一種新的線性減小比生長(zhǎng)速率指數(shù)補(bǔ)料(exponential-feeding based on linear reducing specific-growth-rate, LR-μ-EF)策略。首先，采用該策略進(jìn)行抗凍酵母SaccharomycescerevisiaeAFY-1的3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)試驗(yàn)，比較了培養(yǎng)過(guò)程中生物量的計(jì)算值和實(shí)驗(yàn)值。然后在此基礎(chǔ)上，以最終生物量、收率和生產(chǎn)速度為酵母生產(chǎn)效率的評(píng)價(jià)指標(biāo)，討論了補(bǔ)料速度和累計(jì)補(bǔ)料體積對(duì)酵母生產(chǎn)效率的影響。當(dāng)恒定比生長(zhǎng)速率指數(shù)補(bǔ)料(constant-μexponential-feeding, C-μ-EF)培養(yǎng)階段的比生長(zhǎng)速率(μ)為0.05 h-1、LR-μ-EF培養(yǎng)階段的μ減小速度為0.000 8 h-2時(shí)，生物量的實(shí)驗(yàn)值與計(jì)算值基本一致。在累計(jì)補(bǔ)料體積560 mL的條件下，最終生物量和酵母收率隨著μ減小速度的增大而逐漸上升，當(dāng)μ減小速度為0.000 8 h-2時(shí)分別達(dá)到77.5g/L和38.0%。這與μ減小速度為0(即C-μ-EF策略)時(shí)相比，分別增加了26.7%和27.5%。此外，酵母生產(chǎn)速度基本與μ減小速度無(wú)關(guān)，保持在0.8～0.9g/(L·h)范圍。以上研究結(jié)果表明了LR-μ-EF策略改善酵母生產(chǎn)效率的能力，為酵母的工業(yè)化生產(chǎn)提供了有用信息。

酵母；分批培養(yǎng)；補(bǔ)料策略；比生長(zhǎng)速率；生產(chǎn)效率

酵母在食品、醫(yī)藥、生物工程、發(fā)酵工程、飼料工業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，目前其全球年消費(fèi)量高達(dá)數(shù)百萬(wàn)噸，并仍在不斷增長(zhǎng)[1]。酵母的培養(yǎng)模式直接影響其生產(chǎn)效率和成本，是酵母生產(chǎn)技術(shù)的研究熱點(diǎn)之一[2-3]。從理論上來(lái)說(shuō)，指數(shù)流加培養(yǎng)是一種最為有效的酵母培養(yǎng)模式。指數(shù)流加培養(yǎng)根據(jù)酵母的指數(shù)生長(zhǎng)規(guī)律確定培養(yǎng)基的流加速度，可避免一次性投料培養(yǎng)中的底物抑制問(wèn)題，減少乙醇和其他副產(chǎn)物的形成，從而提高酵母的收率和生產(chǎn)速度[4-6]。

目前關(guān)于酵母指數(shù)流加培養(yǎng)的研究大多數(shù)都假設(shè)培養(yǎng)過(guò)程中酵母的比生長(zhǎng)速率保持恒定，也就是說(shuō)酵母以恒定的比生長(zhǎng)速率按時(shí)間的指數(shù)函數(shù)生長(zhǎng)[7-9]。但實(shí)際上，指數(shù)流加培養(yǎng)過(guò)程中，比生長(zhǎng)速率難以保持恒定。這是因?yàn)殡S著培養(yǎng)的進(jìn)行(特別是在培養(yǎng)的中后期)，酵母、乙醇和溶氧濃度等環(huán)境條件發(fā)生改變，酵母生長(zhǎng)受到抑制[10-12]。此外，合理的比生長(zhǎng)速率也難以確定。若比生長(zhǎng)速率設(shè)定過(guò)高，則培養(yǎng)基供給超出酵母生長(zhǎng)的需要，酵母生長(zhǎng)受到抑制，反之若比生長(zhǎng)速率設(shè)定過(guò)低，則培養(yǎng)基供給不足，限制酵母生長(zhǎng)速度[13]。在指數(shù)流加培養(yǎng)的前期采用較大的比生長(zhǎng)速率，后期采用較小的比生長(zhǎng)速率，可改善溶氧不足問(wèn)題，提高最終生物量[7,14]。因此，本研究根據(jù)糖代謝受到氧和糖濃度雙重影響的酵母生長(zhǎng)特性，提出一種新的線性減小比生長(zhǎng)速率指數(shù)補(bǔ)料(exponential feeding based on linear reducing specific-growth-rate, LR-μ-EF)策略。該補(bǔ)料策略在培養(yǎng)初期采用較大的比生長(zhǎng)速率，而在培養(yǎng)中后期采用隨時(shí)間線性減小的比生長(zhǎng)速率，以達(dá)到提高酵母生產(chǎn)效率的目的。

本文作者在前期研究中以SaccharomycescerevisiaeCGMCC 2.1423為出發(fā)菌株，采用低溫等離子體誘變結(jié)合定向馴化的手段，選育出了1株發(fā)酵能力強(qiáng)的抗凍酵母S.cerevisiaeAFY-1[15]。該酵母冷凍生胚的發(fā)酵力在-20 ℃條件下凍藏7 d時(shí)為冷凍前的93%，35 d以后一直穩(wěn)定在冷凍前的86%，抗凍能力明顯優(yōu)于其他市售酵母。本研究以抗凍酵母S.cerevisiaeAFY-1為實(shí)驗(yàn)菌株，探究LR-μ-EF策略改善酵母生產(chǎn)效率的有效性。首先，采用該策略進(jìn)行抗凍酵母S.cerevisiaeAFY-1的培養(yǎng)，以恒化培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)為依據(jù)計(jì)算指數(shù)補(bǔ)料培養(yǎng)中的生物量，并與實(shí)驗(yàn)值比較；然后在此基礎(chǔ)上，以最終生物量、收率和生產(chǎn)速度為酵母生產(chǎn)效率的評(píng)價(jià)指標(biāo)，討論補(bǔ)料速度和累計(jì)補(bǔ)料體積對(duì)酵母生產(chǎn)效率的影響。

1　指數(shù)補(bǔ)料培養(yǎng)數(shù)學(xué)模型

假設(shè)指數(shù)補(bǔ)料培養(yǎng)過(guò)程中酵母的比生長(zhǎng)速率恒定，且補(bǔ)料速度等于消耗速度，則根據(jù)物料恒算可得如下補(bǔ)料方程[12]：

(1)

式中：F，補(bǔ)料速度，L/h；μ，酵母比生長(zhǎng)速率(即單位質(zhì)量的酵母在單位時(shí)間內(nèi)的生長(zhǎng)量)，h-1；V0，初始罐內(nèi)培養(yǎng)基體積，L；CC0，初始罐內(nèi)生物量，g/L；YC/S，酵母對(duì)葡萄糖的收率，%；CSF，流加培養(yǎng)基的葡萄糖濃度，g/L；CS，罐內(nèi)葡萄糖濃度，g/L；tF，指數(shù)補(bǔ)料培養(yǎng)時(shí)間，h。

對(duì)式(1)進(jìn)行積分，可得到累計(jì)補(bǔ)料體積VSF(L)的計(jì)算式：

(2)

此外，罐內(nèi)生物量CC(g/L)隨指數(shù)補(bǔ)料培養(yǎng)時(shí)間的變化可用式(3)[11]表示：

(3)

式(1)～式(3)中，V0、CSF、CC0、μ、tF為操作參數(shù)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)定。酵母在無(wú)抑制的條件下生長(zhǎng)時(shí)，μ和CS之間的關(guān)系符合Monod方程[16]。經(jīng)過(guò)變換，CS與μ的關(guān)系可以表示為：

(4)

式中，KS，基質(zhì)飽和常數(shù)，g/L；μmax，酵母最大比生長(zhǎng)速率，h-1。

YC/S與μ的關(guān)系可以用式(5)[17]表示：

(5)

式中，QS，基質(zhì)消耗速率，h-1；YG，酵母最大生長(zhǎng)得率系數(shù)；mS，酵母生長(zhǎng)維持系數(shù)，h-1。

本研究分別在稀釋率為0.006、0.01、0.03、0.05 h-1的條件下進(jìn)行抗凍酵母S.cerevisiaeAFY-1的恒化培養(yǎng)，得到μmax=0.31 h-1；KS=0.81 g/L；YG=0.43；mS=0.002 4 h-1。因此在指數(shù)補(bǔ)料培養(yǎng)中，只要設(shè)定μ，即可分別根據(jù)式(4)和式(5)計(jì)算得到CS和YC/S[18]。

對(duì)于線性減小比生長(zhǎng)速率的指數(shù)補(bǔ)料培養(yǎng)，本研究采用時(shí)間差分法計(jì)算補(bǔ)料速度、累計(jì)補(bǔ)料體積和罐內(nèi)生物量。在充分小的時(shí)間間隔內(nèi)，可以認(rèn)為μ恒定不變，式(1)～式(3)成立。

2　材料與方法

2.1酵母菌種

以抗凍酵母S.cerevisiaeAFY-1為實(shí)驗(yàn)菌株。該菌株采用斜面培養(yǎng)基(葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂20 g/L)在4 ℃條件下保存。

2.2培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH，在121 ℃條件下滅菌20 min，冷卻至室溫。

擴(kuò)大培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，酵母浸粉8.9 g/L，無(wú)機(jī)離子母液(KH2PO460 g/L、MgSO420 g/L、CaCl20.2 g/L)3.6 mL/L，維生素母液(肌醇2 g/L、硫胺素0.5 g/L)3.6 mL/L，自然pH。其中，維生素母液采用0.22 μm微濾膜過(guò)濾除菌，其他溶液在121 ℃下滅菌30 min，冷卻至室溫后混合。

流加培養(yǎng)基：葡萄糖500 g/L，酵母浸粉111.46 g/L，無(wú)機(jī)離子母液(KH2PO460 g/L、MgSO420 g/L、CaCl20.2 g/L)45.3 mL/L，維生素母液(肌醇2 g/L、硫胺素0.5 g/L)45.3 mL/L，自然pH。滅菌方法與擴(kuò)大培養(yǎng)基相同。

2.3種子培養(yǎng)

在250 mL三角瓶中裝入100 mL種子培養(yǎng)基，用接種環(huán)將酵母菌種從斜面培養(yǎng)基接種至種子培養(yǎng)基中，在180 r/min、30 ℃的搖床上培養(yǎng)21 h(對(duì)數(shù)期后期，細(xì)胞濃度為1.2×107個(gè)/mL)。

2.4補(bǔ)料分批培養(yǎng)

酵母的補(bǔ)料分批培養(yǎng)分別采用恒定比生長(zhǎng)速率指數(shù)補(bǔ)料(constant-μexponential feeding, C-μ-EF)和線性減小比生長(zhǎng)速率指數(shù)補(bǔ)料(LR-μ-EF)的2種策略進(jìn)行。其中，采用C-μ-EF策略的培養(yǎng)包括2個(gè)階段：無(wú)補(bǔ)料培養(yǎng)階段和C-μ-EF培養(yǎng)階段；采用LR-μ-EF策略的培養(yǎng)包括3個(gè)階段：無(wú)補(bǔ)料培養(yǎng)階段、C-μ-EF培養(yǎng)階段、以及LR-μ-EF培養(yǎng)階段。無(wú)補(bǔ)料培養(yǎng)的目的在于得到一定的酵母生長(zhǎng)速度和生物量，使得指數(shù)補(bǔ)料培養(yǎng)順利進(jìn)行[19]。

(1)無(wú)補(bǔ)料培養(yǎng)

在3 L發(fā)酵罐(BIOTECH-3BG，上海保興生物設(shè)備工程有限公司)中裝入1.0 L擴(kuò)大培養(yǎng)基，接入50 mL種子液，進(jìn)行無(wú)補(bǔ)料的培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度和通氣量分別設(shè)定在30 ℃和200 L/h，罐內(nèi)發(fā)酵液的溶氧量通過(guò)改變攪拌轉(zhuǎn)速(200～800 r/min)控制在30%以上，pH用濃度為2 mol/L的H2SO4溶液和1 mol/L的NaOH溶液控制在5.0左右。

(2)C-μ-EF培養(yǎng)

在無(wú)補(bǔ)料的培養(yǎng)進(jìn)行到24 h時(shí)，罐內(nèi)葡萄糖和乙醇完全消耗。從此開始，按照式(1)向罐內(nèi)供給流加培養(yǎng)基，進(jìn)行C-μ-EF培養(yǎng)。比生長(zhǎng)速率(μ，h-1)設(shè)定為0.05[13]。

(3)LR-μ-EF培養(yǎng)

當(dāng)無(wú)補(bǔ)料及C-μ-EF培養(yǎng)進(jìn)行到40 h時(shí)，開始LR-μ-EF培養(yǎng)。μ與培養(yǎng)時(shí)間t(h)的關(guān)系可用式(6)表示：

μ=0.05-ω(t-40) (ω>0)

(6)

式中，ω，μ的減小速度，h-2。

(4)補(bǔ)料

采用蠕動(dòng)泵(BT100-02-YZ1515，保定齊力恒流泵有限公司)向發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)給流加培養(yǎng)基，當(dāng)累計(jì)補(bǔ)料體積達(dá)到設(shè)定值時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。從理論上來(lái)說(shuō)，補(bǔ)料速度按式(1)計(jì)算，但補(bǔ)料速度隨時(shí)間的變化難以在蠕動(dòng)泵上實(shí)現(xiàn)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用時(shí)間差分法進(jìn)行補(bǔ)料速度的計(jì)算和控制，時(shí)間間隔△t設(shè)定為1 h。在任意時(shí)刻t，根據(jù)式(2)計(jì)算出△t內(nèi)的平均補(bǔ)料速度(L/h)，作為蠕動(dòng)泵在△t內(nèi)的操作值。以μ=0.05 h-1為例，補(bǔ)料速度的計(jì)算值和操作值如圖1所示。

圖1　補(bǔ)料分批培養(yǎng)中補(bǔ)料速度的計(jì)算值和蠕動(dòng)泵操作值(μ=0.05 h-1)Fig.1　Calculated feeding rate and set values for peristaltic pump operation in the fed-batch culture

2.5測(cè)定

培養(yǎng)過(guò)程中，從發(fā)酵罐內(nèi)取出發(fā)酵液試樣10 mL，測(cè)定生物量、乙醇和殘?zhí)菨舛取?/p>

(1)生物量測(cè)定

采用紫外分光光度計(jì)(752S，上海棱光技術(shù)有限公司)在600 nm處測(cè)定試樣的光密度(OD600)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出生物量(干重)。測(cè)定前，根據(jù)需要進(jìn)行稀釋，以保證OD600在0.2～0.8范圍內(nèi)。每個(gè)測(cè)定重復(fù)3次，取平均值。

(2)乙醇和殘?zhí)菨舛葴y(cè)定

試樣的乙醇和殘?zhí)菨舛炔捎蒙飩鞲衅?SBA-40E，山東省科學(xué)院生物研究所)進(jìn)行測(cè)定。將試樣在4 ℃、3 000 r/min條件下離心10 min，取25 μL上清液進(jìn)樣。每個(gè)測(cè)定重復(fù)3次，取平均值。

3　結(jié)果與討論

3.1培養(yǎng)過(guò)程特征

圖2表示C-μ-EF策略應(yīng)用的1例。該實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)24 h的無(wú)補(bǔ)料培養(yǎng)，生物量(CC)達(dá)到12.3 g/L，罐內(nèi)葡萄糖(CS)和乙醇(CE)消耗殆盡，溶氧(DO)也出現(xiàn)急劇上升。因此，在此時(shí)開始C-μ-EF培養(yǎng)，μ設(shè)定為0.05 h-1。在C-μ-EF培養(yǎng)階段，罐內(nèi)葡萄糖濃度無(wú)上升，表明流加培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分被全部利用。生物量的實(shí)驗(yàn)值在52 h前與計(jì)算值基本一致，但在52 h后小于計(jì)算值，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，兩者差別增大。71 h時(shí)，累計(jì)補(bǔ)料體積達(dá)到560 mL，培養(yǎng)終了。此時(shí)，生物量的實(shí)驗(yàn)值為61.2 g/L，遠(yuǎn)小于計(jì)算值82.8 g/L。與生物量的變化相對(duì)應(yīng)，乙醇濃度從52 h時(shí)開始逐漸增加，到71 h時(shí)達(dá)到16.7 g/L。溶氧也在52 h時(shí)開始從30%逐漸下降，71 h時(shí)下降至0。

Ⅰ:無(wú)補(bǔ)料培養(yǎng)階段；Ⅱ:C-μ-EF培養(yǎng)階段，μ=0.05 h-1圖2　C-μ-EF策略應(yīng)用的一例Fig.2　An application example of C-μ-EF strategy

在C-μ-EF培養(yǎng)的中后期，生物量的實(shí)驗(yàn)值小于計(jì)算值，表明部分葡萄糖消耗于酵母的乙醇發(fā)酵途徑，實(shí)際的μ小于其設(shè)定值0.05 h-1。該現(xiàn)象發(fā)生的主要原因是：隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，生物量增加，依靠提高攪拌轉(zhuǎn)速與通氣量已不能滿足酵母生長(zhǎng)的需要，因而發(fā)酵液的溶氧下降，同時(shí)產(chǎn)生了克雷布特效應(yīng)[2,7,20-21]。

為了解決這一問(wèn)題，提高酵母生產(chǎn)效率，本研究提出了LR-μ-EF策略。圖3表示LR-μ-EF策略應(yīng)用的1例。該培養(yǎng)策略包括3個(gè)階段：0～24 h的無(wú)補(bǔ)料培養(yǎng)階段、24～40 h的C-μ-EF培養(yǎng)階段、40～102 h的LR-μ-EF培養(yǎng)階段。在C-μ-EF培養(yǎng)階段，μ同樣設(shè)定為0.05 h-1；在LR-μ-EF培養(yǎng)階段，μ按式(6)線性減小，其中ω設(shè)定為0.000 8 h-2。在整個(gè)C-μ-EF和LR-μ-EF培養(yǎng)階段，罐內(nèi)葡萄糖(CS)和乙醇(CE)濃度無(wú)上升，溶氧(DO)始終維持在30%以上，生物量(CC)的實(shí)驗(yàn)值與計(jì)算值基本一致。102 h時(shí)，累計(jì)補(bǔ)料體積達(dá)到560 mL，培養(yǎng)終了。此時(shí)，生物量達(dá)到77.5 g/L，與C-μ-EF策略相比提高了26.7%。由此可見，采用LR-μ-EF策略，可避免發(fā)酵液溶氧不足、克雷布特效應(yīng)等問(wèn)題。

Ⅰ：無(wú)補(bǔ)料培養(yǎng)階段；Ⅱ：C-μ-EF培養(yǎng)階段，μ(h-1)=0.05；Ⅲ：LR-μ-EF培養(yǎng)階段，μ(h-1)=0.05-0.0008(t-40)圖3　LR-μ-EF策略應(yīng)用的一例Fig.3　An application example of LR-μ-EF strategy

3.2μ減小速度對(duì)酵母生產(chǎn)效率的影響

酵母生產(chǎn)效率采用最終生物量(CCF，g/L)、收率(YC/S，%)和生產(chǎn)速度[RC，g/(L·h)]進(jìn)行評(píng)價(jià)。其中，CCF表示培養(yǎng)結(jié)束時(shí)單位體積的發(fā)酵液所含的酵母質(zhì)量，強(qiáng)調(diào)酵母培養(yǎng)能力；YC/S表示生產(chǎn)酵母質(zhì)量與消耗葡萄糖質(zhì)量的百分比，強(qiáng)調(diào)基質(zhì)利用效率；RC表示整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中單位體積的發(fā)酵液在單位時(shí)間內(nèi)的生產(chǎn)酵母質(zhì)量，強(qiáng)調(diào)酵母生產(chǎn)強(qiáng)度。

μ的減小速度可用式(6)中的ω來(lái)表示。ω越大，則μ減小速度越大。將ω分別設(shè)定為0、0.000 3、0.000 6和0.000 8 h-2，進(jìn)行酵母的指數(shù)補(bǔ)料培養(yǎng)，當(dāng)累計(jì)補(bǔ)料體積達(dá)到560 mL時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。ω對(duì)酵母生產(chǎn)效率的影響如圖4所示。在0～0.000 8 h-2的ω范圍內(nèi)，最終生物量、酵母收率和生產(chǎn)速度的實(shí)驗(yàn)值均小于計(jì)算值。在理論計(jì)算中，因?yàn)榻湍甘章屎团囵B(yǎng)基消耗量均為定值，所以最終生物量和酵母收率的計(jì)算值與ω的大小無(wú)關(guān)，分別保持在82.6 g/L和40.1%。而在實(shí)際上，ω=0(即C-μ-EF策略)時(shí)，最終生物量和酵母收率的測(cè)定值分別僅為61.2 g/L和29.8%。最終生物量和酵母收率的測(cè)定值隨ω的增大而逐漸上升，當(dāng)ω=0.000 8 h-2時(shí)分別上升到77.5 g/L和38.0%，比ω=0時(shí)分別增加了26.7%和27.5%。

圖4中，酵母生產(chǎn)速度的實(shí)驗(yàn)值和計(jì)算值都隨ω的增大逐漸下降。但另一方面，實(shí)驗(yàn)值和計(jì)算值的差別隨ω的增大逐漸縮小。其原因是酵母收率的實(shí)驗(yàn)值隨ω的增大逐漸上升，酵母生產(chǎn)速度實(shí)驗(yàn)值的下降幅度較小。酵母生產(chǎn)速度的實(shí)驗(yàn)值和計(jì)算值在ω=0時(shí)分別為0.9和1.2g/(L·h)，在ω=0.000 8 h-2時(shí)均下降到0.8 g/(L·h)。

圖4　ω對(duì)酵母生產(chǎn)效率的影響Fig.4　Effect of ω on the yeast production efficiency

3.3累計(jì)補(bǔ)料體積對(duì)酵母生產(chǎn)效率的影響

累計(jì)補(bǔ)料體積表示指數(shù)補(bǔ)料培養(yǎng)的延續(xù)性。在式(6)中ω=0(即C-μ-EF策略)和ω=0.000 8 h-2(即LR-μ-EF策略)的條件下，將累計(jì)補(bǔ)料體積分別設(shè)定為200、300、400、560 mL，進(jìn)行酵母培養(yǎng)。累計(jì)補(bǔ)料體積對(duì)酵母生產(chǎn)效率的影響如圖5所示。在2種不同策略的培養(yǎng)中，最終生物量(CCF)均隨累計(jì)補(bǔ)料體積的增大呈上升趨勢(shì)。當(dāng)累計(jì)補(bǔ)料體積從200 mL增加到560 mL時(shí)，ω=0條件下的最終生物量從43.4 g/L上升到61.2 g/L，而ω=0.000 8 h-2條件下的最終生物量從46.7 g/L上升到77.5 g/L。與ω=0條件相比，ω=0.000 8 h-2條件下最終生物量的上升幅度較大。與最終生物量相反，酵母收率(YC/S)隨累計(jì)補(bǔ)料體積的增大呈下降趨勢(shì)。當(dāng)累計(jì)補(bǔ)料體積從200 mL增加到560 mL時(shí)，ω=0條件下的酵母收率從36.2%下降到29.8%，而ω=0.000 8 h-2條件下的酵母收率從40.9%下降到38.0%。與ω=0條件相比，ω=0.000 8 h-2條件下酵母收率的下降幅度較小。

圖5中，酵母生產(chǎn)速度(RC)在ω=0和ω=0.000 8 h-2條件下與累計(jì)補(bǔ)料體積無(wú)關(guān)，基本保持在0.8 g/(L·h)。

由上述可見，在200～560 mL的累計(jì)補(bǔ)料體積范圍內(nèi)，LR-μ-EF策略與C-μ-EF策略相比，可提高最終生物量和酵母收率，同時(shí)保持酵母生產(chǎn)速度基本不變。

圖5　累計(jì)補(bǔ)料體積對(duì)酵母生產(chǎn)效率的影響Fig.5　Effect of overall feeding volume on the yeast production efficiency

ATASOY等[2]認(rèn)為，在面包酵母的培養(yǎng)中需要從基質(zhì)和空氣供給速度的兩方面限制乙醇生成，提高生物量。他們將基質(zhì)和空氣供給的動(dòng)態(tài)方程轉(zhuǎn)換成非線性規(guī)劃問(wèn)題，并建立了控制矢量的優(yōu)化演算方法，為動(dòng)態(tài)發(fā)酵操作提供了理論依據(jù)。CHOPDA等[6]采用基于TCP/IP協(xié)議的解耦幾何控制器(decoupled input-output linearizing controller，DIOLC)進(jìn)行面包酵母培養(yǎng)中葡萄糖和溶氧的動(dòng)態(tài)控制，使得最終生物量比采用PID控制器時(shí)提高了23%。DIOLC控制器對(duì)基質(zhì)和溶氧控制更加精細(xì)，有助于生物量的最大化。與此相比，本研究提出的LR-μ-EF策略，顯示了操作方便、酵母生產(chǎn)效率高的特點(diǎn)。

酵母生產(chǎn)效率不僅與補(bǔ)料策略有關(guān)，而且受菌種、發(fā)酵罐等多種因素的影響。目前的酵母工業(yè)化生產(chǎn)中，通常根據(jù)培養(yǎng)液中葡萄糖和乙醇的濃度來(lái)進(jìn)行補(bǔ)料速度的反饋控制。可以推測(cè)，采用本研究提出的補(bǔ)料策略，同時(shí)結(jié)合發(fā)酵液中葡萄糖、乙醇濃度等測(cè)定值實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)系統(tǒng)狀態(tài)，調(diào)整補(bǔ)料速度，則可進(jìn)一步提高酵母生產(chǎn)效率。

4　結(jié)論

提出一種新的LR-μ-EF策略，并采用該策略進(jìn)行抗凍酵母S.cerevisiaeAFY-1的3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)試驗(yàn)。得到的結(jié)論如下：

(1)當(dāng)C-μ-EF培養(yǎng)階段的μ為0.05 h-1、LR-μ-EF培養(yǎng)階段的μ減小速度為0.000 8 h-2時(shí)，罐內(nèi)葡萄糖和乙醇濃度無(wú)上升，溶氧始終維持在30%以上，生物量的實(shí)驗(yàn)值與計(jì)算值基本一致。

(2)在累計(jì)補(bǔ)料體積560 mL的條件下，最終生物量和酵母收率隨著μ減小速度的增大而逐漸上升。當(dāng)μ減小速度為0.000 8 h-2時(shí)，最終生物量和酵母收率分別為77.5 g/L和38.0%，與μ減小速度為0(即C-μ-EF策略)時(shí)相比分別增加了26.7%和27.5%。酵母生產(chǎn)速度基本與μ減小速度無(wú)關(guān)，保持在0.8～0.9 g/(L·h)范圍。

(3)當(dāng)累計(jì)補(bǔ)料體積從200 mL增加到560 mL時(shí)，最終生物量和酵母收率在μ減小速度0.000 8 h-2的條件下分別增加和減少30.8 g/L、2.9%，而在μ減小速度0的條件下分別增加和減少17.8 g/L、6.4%。酵母生產(chǎn)速度與累計(jì)補(bǔ)料體積無(wú)關(guān)。

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Improvement of yeast production efficiency by an exponential feeding strategy based on linear reducing specific-growth-rates

JI Meng1, MIAO Ye-lian1*, CHEN Jie Yu2, YOU Ye-bing1,LIU Fei-long1, XU Lin3

1(College of Food Science and Light Industrial Engineering, Nanjing Technology University, Nanjing 211800, China)2(Faculty of Bioresource Science, Akita Prefectural University, Akita 010-0195, Japan)3(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Technology University, Nanjing 211800, China)

The production efficiency and cost of yeasts depend greatly on culture modes. A novel strategy for exponential feeding based on linear reducing specific-growth-rate (LR-μ-EF strategy) was proposed according to their growth characteristics. Fed-batch culture of freeze-tolerant yeastSaccharomycescerevisiaeAFY-1 was carried out in a 3L stirred tank bioreactor with the feeding strategy. The experimental values of biomass during culture were compared with calculated values. Then, the effects of feeding rate and overall feeding volume on yeast production efficiency were discussed, where the yeast production efficiency was evaluated based on final biomass, yeast yield and production rate. When the specific-growth-rate (μ) was 0.05 h-1in constant-μexponential feeding (C-μ-EF) culture stage, and theμdecrease rate was 0.000 8 h-2in LR-μ-EF culture stage, the experimental values of biomass agreed well with the calculated values. Under the condition of an overall feeding volume at 560 mL, the biomass and the yeast yield increased with the increasing ofμdecrease rate, and reached 77.5 g/L and 38.0% at theμdecrease rate of 0.000 8 h-2, respectively, which respectively increased by 26.7% and 27.5% in comparison with those in the culture withμdecrease rate of 0 (i.e. C-μ-EF strategy). In addition, the yeast production rate had no significant relationship withμdecrease rate, and fluctuated in the range of 0.8-0.9 g/(L·h). The results demonstrated superior capability of LR-μ-EF strategy for the improvement of yeast production efficiency, and provide useful information for the industrial production of yeasts.

yeast; batch culture; feeding strategy; specific growth rate; production efficiency

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609006

碩士研究生(繆冶煉教授為通訊作者,E-mail：ylmiao@njtech.edu.cn)。

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2011CBA00807)

2016-03-21，改回日期：2016-04-27