結膜瓣遮蓋治療角膜堿燒傷中PMNs浸潤的變化

宋東宇，高明宏，崔珊珊

?

·實驗研究·

結膜瓣遮蓋治療角膜堿燒傷中PMNs浸潤的變化

宋東宇1，高明宏2，崔珊珊1

1Department of Ophthalmology,Chaoyang Central Hospital,Chaoyang 110016,Liaoning Province,China;2Department of Ophthalmology,the General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,Liaoning Province,China

Abstract

?AIM: To study the infiltration of polymorphonuclear neutrophils (PMNs) after conjunctival flap covering in alkali-burned cornea.

?METHODS: Rabbit cornea alkali-burned model was made,then 50 rabbits were randomly divided into the experimental group (n=25) and the control group (n=25).At the same time the surgery of conjunctival flap covering was given to rabbits of the experimental group.The condition developing of alkali-burned cornea was observed by slit lamp biomicroscopy,and took photos in two groups.The infiltration of PMNs was identified by hematoxylin eosin (HE) staining in different periods.

?RESULTS:The quantity of PMNs increased on the 3d,reached the lower level on 7d,shown a peak on the 14d,then decreased gradually.PMNs level of the experimental group was significantly lower than that in the control group,and the difference of 3,14 and 21d was significant (P<0.05).

?CONCLUSION: During the wound healing process,alkali-burned cornea has close relation with the infiltration of PMNs.The treatment of conjunctival flap covering for the severe alkali-burned cornea was found to have good effect.

目的：研究結膜瓣遮蓋術治療角膜堿燒傷的療效及損傷修復中多形核中性白細胞(polymorphonuclear neutrophils，PMNs)的浸潤情況。

方法：選取50只兔，隨機分為兩組，每組25只，即實驗組和對照組，并建立兔角膜堿燒傷模型。實驗組在角膜堿燒傷后當天行結膜瓣遮蓋術。裂隙燈下觀察兩組角膜病損恢復情況并照相。采用蘇木素-伊紅(HE)染色切片后測定兩組角膜堿燒傷后不同時間點PMNs的浸潤量值。

結果：PMNs在角膜堿燒傷后的3d開始升高，大量浸潤角膜，7d略有下降，14d上升達到最大峰值，之后逐漸降低，早期分布在燒傷部位角膜基質內，后期則與潰瘍浸潤面積相一致。實驗組PMNs的計數均明顯低于對照組，且角膜堿燒傷后的3、14和21d的差異有統計學意義(P<0.05)。結論：結膜瓣遮蓋治療重度角膜堿燒傷的療效確切，角膜的病理損傷和修復與PMNs的浸潤密切相關。

結膜瓣；角膜堿燒傷；多形核中性白細胞

引用：宋東宇，高明宏，崔珊珊.結膜瓣遮蓋治療角膜堿燒傷中PMNs浸潤的變化.國際眼科雜志2016;16(10):1824-1827

0　引言

角膜堿燒傷是一種病損較重且難以治療的化學性眼外傷，由于堿能溶解脂肪和蛋白質，易于浸潤至角膜深層，造成嚴重的角膜潰瘍溶解，期間發生了復雜的炎性反應，導致大量多形核中性白細胞(polymorphonuclear neutrophils，PMNs)浸潤，進而導致眾多損傷因子、蛋白酶類破壞角膜組織。在治療中，角膜堿燒傷后損傷修復的機制復雜，如何抑制炎癥反應，如何認識炎癥反應在角膜損傷中的分子機制，尚需研究。本實驗通過在體動物角膜模型的建立，探究結膜瓣遮蓋治療角膜堿燒傷的手術療效及 PMNs在損傷修復過程中的浸潤時相，為臨床治療提供理論基礎。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康日本白兔50只(沈陽藥科大學動物實驗中心提供)，12月齡，體質量2.0～2.5kg，雌雄各半，右眼為實驗眼，實驗前裂隙燈下眼部檢查無病變，按體質量和性別隨機分為實驗組和對照組各25只，相同條件下飼養。實驗過程中，動物的使用遵循國家科技部頒布的《實驗動物管理條例》。

1.1.2主要儀器裂隙燈顯微鏡(SL-6E，Topcon)、手術顯微鏡(SN.MD-2，日本)、恒溫水浴箱(ZD600，杭州)、凈化工作臺(SW-CJ-IFD，江蘇)、振蕩器(JHYC-3，北京)、切片機(HM325，德國)、漂烘處理儀(PHY-3，廣東)、圖像分析儀(Image8000，澳大利亞)、生物顯微鏡(CK×53，Olympus)和Image Plus5.0圖像分析系統。

1.2方法

1.2.1兔角膜堿燒傷模型的建立應用8.0mm直徑角膜環鉆鉆取數張圓形單層濾紙片(確保濾紙片大小一致)，浸潤于1.0mol/L NaOH溶液中至飽和，撈取備用。固定實驗兔，右眼表面麻醉，應用20g/L丙美卡因眼液點眼3次，開瞼器開瞼后，將備用的濾紙片置于兔中央角膜區，使濾紙片與角膜表面充分貼附，1min后迅速取下，立即用大量生理鹽水沖洗角結膜表面及上下結膜穹隆部5min，5g/L阿托品眼用凝膠涂患眼。依據全國眼外傷職業病學組通過的標準使兔角膜達到Ⅲ級堿燒傷程度，按此方法對實驗組和對照組各25只兔右眼均進行角膜堿燒傷模型的建立。

1.2.2結膜瓣遮蓋手術方法對實驗組25只兔的右眼均在角膜堿燒傷模型建立的當日行結膜瓣遮蓋術，具體方法如下：兔腹腔內注射10g/L戊巴比妥鈉45mg進行全身麻醉，注意進針深度避免損傷腹腔臟器，麻醉滿意后右眼上置開瞼器，注射生理鹽水將球結膜與下方筋膜組織分離，手術顯微鏡下沿角膜緣360°環形切開球結膜，將結膜與筋膜充分分離至穹隆部，刮除殘存的周邊角膜上皮層，用游離的結膜瓣完整覆蓋角膜，10-0手術縫線連續對位縫合結膜瓣。同時刮除對照組右眼角膜堿燒傷后周邊殘存的上皮組織。手術操作均由同一技術熟練的實驗人員完成。

1.2.3治療用藥和處理堿燒傷后3d內實驗組和對照組兔右眼均給予藥物治療，阿托品眼用凝膠，1次/d；小牛血去蛋白提取物眼用凝膠，3次/d。分別于3、7、14、21和28d隨機選取實驗組和對照組各5只兔，腹腔注藥麻醉后對右眼進行裂隙燈檢查及眼前節照相，通過耳緣靜脈注入5mL空氣窒息處死。

1.2.4標本獲取和處理處死兔后，用力擠壓眶周使眼球突出，快速摘除右眼球，沿角鞏膜緣環形切取角膜，實驗組注意保留角膜表面的結膜瓣，甲醛溶液固定，酒精梯度脫水，二甲苯溶液透色，常規石蠟包埋，5μm連續切片，脫蠟后常規蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色。400倍顯微鏡下觀察HE染色切片，胞核藍色深染的為PMNs。

2　結果

2.1裂隙燈顯微鏡下觀察兔右眼瞼紅腫逐漸消退，初期眼球表面大量粘稠分泌物，燒傷的角膜中央可見邊界欠清的灰白色潰瘍病灶，深達基質層，眼內結構窺視不清。14d對照組角膜潰瘍面積及深度最重，周邊生長大量新生血管，角膜潰瘍溶解最為嚴重；14d實驗組結膜瓣水腫，與角膜緊密附著，呈淺灰白色，縫線處愈合良好，結膜瓣下隱約可見角膜潰瘍溶解較輕；28d對照組角膜潰瘍病灶大面積瘢痕化，表面大量新生血管，透明度差；28d實驗組結膜瓣已大部分溶解變薄，角膜病灶趨于結膜化，瘢痕較輕，新生血管較少，潰瘍愈合良好，角膜透明度明顯優于同期對照組。角膜堿燒傷后的溶解高峰出現在堿燒傷后的14d(圖1)。

2.2HE染色切片觀察在顯微鏡400倍下觀察HE染色切片，胞核藍色深染的為PMNs。角膜堿燒傷后，3d對照組潰瘍病灶區上皮缺失，上皮下可見PMNs，基質層水腫增厚，膠原纖維已見紊亂；3d結膜瓣遮蓋的實驗組損傷明顯減輕，PMNs較少，基質的膠原纖維尚清晰平整，結膜瓣尚未與角膜表層粘合溶解，易于脫離。對照組14d，堿燒傷的角膜上皮層部分恢復，細胞水腫，基質增厚，板層纖維斷裂溶解，特別是壞死區、潰瘍區及鄰近潰瘍的上皮細胞下可見大量PMNs浸潤，大量新生血管，膠原纖維排列明顯紊亂；而結膜瓣遮蓋14d的實驗組結膜瓣已與角膜基質大部分融合，基質層細胞排列較整齊，水腫增厚較輕，且均勻增厚，膠原纖維排列紊亂較輕，結膜瓣下炎性細胞及基質層中新生血管較少(圖2)。

2.3PMNs的量值經檢驗分析，實驗數據服從正態分布，滿足方差齊性，實驗組PMNs數密度值明顯低于對照組(F=18.31，P=0.000)，PMNs數密度值隨時間延長出現明顯波動(先上升后下降)(F=41.15，P=0.000)，差異均有統計學意義(P<0.05)。不同時間點實驗組PMNs數密度值均低于對照組，組間均數比較用兩樣本t檢驗(表1)，3、14和21d差異明顯，具有統計學意義(P<0.05)。實驗組及對照組的組內各時間點的PMNs數密度值相互比較用SNK-q檢驗(表2)，可見不同時間點PMNs數密度值變化明顯(P<0.05)，堿燒傷后3d即有大量PMNs產生，7d時有所下降，之后明顯提升且在14d時達到高峰，14d后逐漸降低，在28d降至接近燒傷7d時水平。

3　討論

結膜瓣遮蓋術在臨床治療中經常用于治療重度角膜潰瘍及燒傷，而動物實驗研究報道較少，其手術靈活簡單，無需復雜的手術設備及器械，不受材料的制約，且治療費用低，術后療效好。手術技巧在于結膜瓣應薄而均勻，少含或不含下方的筋膜組織，避免出現結膜孔洞，結膜瓣應充分遮蓋角膜病灶，術中張力較大時應淺層鞏膜固定。本實驗在術中徹底清除了殘存的角膜上皮層，避免結膜瓣與角膜病灶不融合，為了達到同等實驗條件，對照組也刮除了殘存的角膜上皮層。在臨床治療中應徹底清除所有的角膜病灶區的壞死組織后再行遮蓋術，而本文未清除角膜病灶，以利于與對照組在同等條件下進行對比觀察。值得注意的是兔角膜的直徑較大，應充分圓周分離結膜瓣，必要時切除第三眼瞼才能達到全角膜遮蓋的治療目的。

圖1裂隙燈顯微鏡觀察角膜堿燒傷情況A：堿燒傷后14d； B：結膜瓣遮蓋后14d；C：堿燒傷后28d；D：結膜瓣遮蓋后28d；A與B比較，C與D比較，均可見堿燒傷后的對照組較結膜瓣遮蓋的實驗組角膜表面新生血管更多，角膜透明度更差。

圖2HE染色切片觀察PMNs的表達和新生血管(×400)A：堿燒傷后3d；B：結膜瓣遮蓋后3d；C：堿燒傷后14d；D：結膜瓣遮蓋后14d。三角示PMNs，箭頭示新生血管；A與B比較，C與D比較，均可見堿燒傷后的對照組較結膜瓣遮蓋的實驗組PMNs和新生血管增多，角膜基質纖維更為紊亂。

表2兔角膜組織中不同時間點PMNs數密度值的組內相互比較

組內比較實驗組qP對照組qP3d與7d0.8302>0.056.6104<0.013d與14d22.1376<0.0117.4789<0.013d與21d16.2404<0.0113.7110<0.013d與28d1.7833>0.058.2960<0.017d與14d22.9678<0.0124.0892<0.017d與21d17.0705<0.0120.3213<0.017d與28d0.9531>0.051.6856>0.0514d與21d5.8972<0.013.7679<0.0514d與28d23.9209<0.0125.7749<0.0121d與28d18.0237<0.0122.0070<0.01

結膜瓣遮蓋治療角膜堿燒傷及抑制PMNs浸潤的機制尚不明確，通過遮蓋的結膜瓣人為造成“角膜上皮化”，機械性保護角膜創面，減弱溶解酶、鐵蛋白酶和膠原蛋白酶的溶解作用，減弱眼表炎性分泌物的應激刺激，加速了損傷修復的進程，促進了結膜瓣與角膜潰瘍區的溶解愈合。結膜瓣含有豐富的血液和淋巴液，與燒傷角膜的密切接觸，可將結膜固有營養物質，包括細胞修復成分和生長因子運送到角膜病灶區，提高了局部抗炎能力，抑制了PMNs的浸潤，控制了潰瘍的發展，促進上皮和基質的愈合。在角膜潰瘍病灶區炎細胞浸潤部位，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達明顯增強，表明VEGF與炎性細胞主要是PMNs關系密切，VEGF促進了角膜病灶區新生血管的生成[1]，這與我們在結膜瓣遮蓋治療角膜堿燒傷中抑制PMNs的浸潤中同時也減少了新生血管生成的結果相一致。在我們的實驗中，不同時間點實驗組PMNs的浸潤量值均低于對照組，且3、14d和21d差異明顯具有統計學意義，實驗組角膜的恢復情況及透明度明顯優于對照組，證實了結膜瓣遮蓋在抑制PMNs浸潤的同時促進了堿燒傷角膜的潰瘍愈合。

McCulley將化學性眼部燒傷的病程分為4個時期，分別是燒傷期(燒傷當時)、急性期(0～7d)、修復早期(1～3wk)和修復晚期(3wk以上)[2-3]，本實驗研究的是角膜燒傷期、急性期和修復早期三個時相。我們通過建立動物模型，對實驗組進行手術干預治療，并作組間和組內比較，觀察急性期及修復早期堿燒傷角膜的組織學改變及潰瘍病灶中PMNs的浸潤時相。角膜堿燒傷后3d即有大量PMNs浸潤，而7d有所下降，高峰出現在傷后的14d，此時是角膜潰瘍活躍期，PMNs量值最大，且SNK-q檢驗中第14d組與其他各組比較均有統計學意義，角膜溶解的病理損傷過程與PMNs的浸潤密切相關，這與Sosne等[4]研究一致。在位置分布規律上，早期PMNs分布在病灶邊緣角膜上皮及基質內，角膜表面少量浸潤；后期PMNs浸潤面積與潰瘍部位一致，這與Peebo等[5]的研究相符。有研究表明角膜堿燒傷后，潰瘍病灶表層大量PMNs生成，浸潤角膜基質層并不斷吞噬壞死組織，直至引起PMNs的細胞溶酶體破裂，溶酶體酶大量進入角膜病灶區，溶解角膜膠原蛋白，其中以金屬蛋白酶對角膜基質層損傷較重，而金屬蛋白酶MMP-9主要來源于PMNs[6]。在我們以往的研究中也表明PMNs與MMP-9的浸潤具有一致性，PMNs還能分泌蛋白溶解酶原激活因子，產生大量纖維蛋白溶解酶來降解纖維蛋白和纖維連接蛋白，使部分修復的潰瘍創面再次病損溶解[3]。我們通過結膜瓣遮蓋病損潰瘍的角膜，抑制了PMNs的浸潤，減輕了角膜病損區的炎性反應，減弱了與PMNs密切相關的金屬蛋白酶和蛋白溶解酶原激活因子對角膜病灶的損傷，從而有利于堿燒傷角膜的損傷恢復。本實驗中對PMNs浸潤時相的研究，有利于指導臨床治療用藥，傷后3d即需廣譜抗生素眼水控制炎癥細胞PMNs的浸潤，進而減少金屬蛋白酶和蛋白溶解酶原激活因子的分泌，有效地控制潰瘍的進展。在角膜堿燒傷后的1wk內，可以適量地應用類固醇激素眼水，而7～21d是角膜堿燒傷后的潰瘍期，類固醇會通過降低膠原合成，抑制角膜基質的修復。

本研究中實驗組和對照組均未應用抗生素眼液，有利于證實結膜瓣遮蓋術控制角膜堿燒傷炎癥反應的療效，闡明炎癥反應中PMNs的浸潤時相，指導臨床治療。而在臨床治療中，除了炎性反應的損傷因素外，角膜堿燒傷是多因素的損傷過程，如何有效防治角膜潰瘍溶解、新生血管化和纖維化，尚待深入研究。

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4Sosne G,Christopherson PL,Barrett RP,et al.Thymosin beta 4 modulates corneal matrix metalloproteinase levels and polymorphonuclear cell infiltration after alkali injury．Invest Ophthalmol Vis Sci 2005;46(7)：2388-2395

5Peebo BB,Gan L,Sun XF,et al.Expression of the focal adhesion protein PINCH in normal and alkali-injured corneas and the role of PMNs.Acta Ophthalmologica Scandinavica 2007;85(4)：395-400

6Xiao O,Xie ZL,Wu B,et al.Minocycline inhibits alkali burn-induced corneal neovascularization in mice.PloSOne 2012:7(7):418-458

Changes in infiltration of polymorphonuclear neutrophils in alkali-burned cornea of conjunctival flap covering

Dong-Yu Song1,Ming-Hong Gao2,Shan-Shan Cui1

Shan-Shan Cui.Department of Ophthalmology,Chaoyang Central Hospital,Chaoyang 122000,Liaoning Province,China.song1567eye@163.com

2016-06-30Accepted：2016-09-01

conjunctival flap; alkali-burned cornea; polymorphonuclear neutrophils

1(122000)中國遼寧省朝陽市中心醫院眼科；2(110016)中國遼寧省沈陽市，沈陽軍區總醫院眼科

宋東宇，男，醫學碩士，主治醫師，研究方向：角膜病的基礎與臨床。

崔珊珊，女，畢業于中國醫科大學，研究生學歷，主任醫師，眼科主任，研究方向：眼表疾病與白內障.song1567eye@163.com

2016-06-30

2016-09-01

Song DY,Gao MH,Cui SS.Changes in infiltration of polymorphonuclear neutrophils in alkali-burned cornea of conjunctival flap covering.Guoji Yanke Zazhi(Int Eye Sci) 2016;16(10):1824-1827

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.10.09