microRNA-132在人臍靜脈內皮細胞中調控作用的研究

張櫪心，陶利娟

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·實驗論著·

microRNA-132在人臍靜脈內皮細胞中調控作用的研究

張櫪心，陶利娟

Department of Ophthalmology,Hunan Children’s Hospital,Changsha 410007,Hunan Province,China

Abstract

?AIM: To evaluate the regulatory effect of microRNA-132 (miR-132) in human umbilical vein endothelial cell (HUVEC).

?METHODS: In vitro cultured human umbilical vein endothelia cells in hypoxic environment for 6h,then maintained under normal oxygen condition for 3h,6h,12h,24h.miR-132 and peroxisome-proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α (PGC-1α) expression was detected by quantitative Real-time polymerase chain reaction and Western blot analysis.Human umbilical vein endothelial cells transfected miR-132 mimic and miR-132 inhibitor(anti-miR-132) were measured by quantitative Real-time polymerase chain reaction and Western blot.

?RESULTS: miR-132 and PGC-1α expression was significantly (P<0.01) upregulated in the hypoxic environment of cells at 3h compared with the normal oxygen condition.After cells transfection,the hypoxic environment the miR-132 and PGC-1α expression were markedly increased compared with the normal oxygen condition.The cells transfected miR-132-mimic,the expression of the miR-132 and PGC-1α were higher than that of transfected anti-miR-132 and contrast group (P<0.01).

?CONCLUSION: miR-132 level is highly expressed in the HUVEC under hypoxia and may be an effect of regulation for PGC-1α.

目的：探討miR-132在人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelia cells，HUVEC)中的調控作用。

方法：體外低氧培養人臍靜脈內皮細胞6h后繼續常氧培養3、6、12、24h，利用Real-time PCR檢測miR-132和PGC-1α mRNA表達變化，Western-blot檢測PGC-1α 蛋白表達變化，及觀察各組與正常培養的細胞之間的表達差異。通過對人臍靜脈內皮細胞轉染miR-132模擬物與拮抗劑后，再分別置于常氧和低氧環境中培養，利用Real-time PCR檢測不同氧條件下miR-132和PGC-1α mRNA的表達變化，Western-blot檢測PGC-1α蛋白表達變化。

結果：miR-132和PGC-1α在細胞低氧培養后繼續常氧培養3h時蛋白與mRNA表達量最高，與正常培養的細胞表達差異最為明顯(P<0.01)。細胞轉染后可觀察到miR-132和PGC-1α在低氧組表達量要高于常氧組，而兩組中轉染miR-132模擬物后的表達量要高于轉染拮抗劑組(P<0.01)。

結論：miR-132在低氧時的人臍靜脈內皮細胞中表達明顯上調，對PGC-1α存在調控作用。

microRNA-132；過氧化物酶增殖激活受體-γ共激活子-1α；人臍靜脈內皮細胞；缺氧

引用：張櫪心，陶利娟.microRNA-132在人臍靜脈內皮細胞中調控作用的研究.國際眼科雜志2016;16(10):1820-1823

0　引言

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類生物內源的非編碼小RNA，由20～24個核苷酸組成，通過與mRNA轉錄物的3’非翻譯區結合而調控基因轉錄后表達[1]。miR-132是發現較早的miRNA之一，2002年馬克斯普朗克學會的Lagos-Quintana等首次在小鼠神經組織中發現miR-132[2]，成熟的miR-132長度為22bp，由長度為66bp的前體序列進行加工而成[3]，miR-132具有進化保守性，在人、大鼠、小鼠、猿等物種中具有相同的序列與結構。作為內皮細胞特異性miRNA之一，miR-132在內皮靶向p120RasGAP誘導新血管形成被稱為血管生成開關。調查結果顯示，在人類血管生成的胚胎干細胞模型中，miR-132高度上調，這在正常內皮中是檢測不到的[4]。前期研究中，我們已經發現過氧化物酶增殖激活受體-γ共激活子-1α(peroxisome proliferator activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α)參與了調控小鼠視網膜新生血管形成[5]。本研究中，我們將體外培養人臍靜脈內皮細胞，并進行缺氧培養，觀察缺氧狀態下miR-132和PGC-1α的表達變化，同時對細胞進行轉染miR-132模擬物(miR-132 mimic)和miR-132拮抗劑(anti-miR-132)，觀察在缺氧與常氧環境中兩者的表達變化情況，從而為缺氧誘導的新生血管性疾病的發病機制和診治研究提供新的思路基礎。

1　材料和方法

1.1材料人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelia cells，HUVEC)由湖南湘雅醫院皮膚科惠贈，脂質體Lipofectamine TM 2000(LF2000)和Trizol均購自美國Invitrogen公司，EGM培養基、Opti-MEM培養基及新生胎牛血清購自Gibco公司，實時定量PCR試劑盒購自美國MBI公司，RT-PCR引物由上海捷瑞生物技術服務有限公司合成，miR-132-mimic和 anti-miR-132由廣州銳博生物科技有限公司合成。兔抗鼠PGC-1α抗體購自美國Abcam公司，兔抗鼠β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養分組體外培養HUVEC，細胞進入對數期生長后，更換培養液，再將細胞分別置于常氧(20% O2)和低氧(1% O2、5% CO2和94% N2混合氣體)環境中培養，低氧培養6h后，再恢復常氧培養3、6、12、24h。對各時間點的細胞檢測miR-132和PGC-1α的表達變化。

1.2.2脂質體介導細胞轉染HUVEC轉染mir-132-mimic和anti-miR-132及陰性對照物，細胞在轉染的前1d，將5×104細胞接種在6孔板上，按Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書進行轉染。設置空白組、陰性對照組(NC、將miR-132序列隨機打亂)、miR-132模擬物組(mir-132-mimic)、miR-132拮抗劑組(anti-miR-132)。mir-132-mimic合成序列：5’-ACCGUGGCUUUCGAUUGUUACU-3’；anti-mir-132合成序列： 5’-AGUAACAAUCGAAAGCCACGGU-3’。細胞轉染后分別置于常氧(20% O2)和低氧(1% O2)環境中繼續培養16h后，對不同氧環境的各組細胞檢測miR-132和PGC-1α的表達變化。

1.2.3qPCR檢測miR-132與PGC-1α mRNA表達的變化提取各組的總RNA，miR-132引物序列：上游： 5’-GGCAACCGTGGCTTTCGA-3’；下游：5’-TTTGGCACTAGCACATT-3’。U6內參基因引物：上游：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；下游：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。 PCR反應條件為：95℃預變性5min，95℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 10s，共40個循環。PGC-1α引物序列：上游：5’-CCTGCATGAGTGTGTGCTCT-3’；下游：5’-GCAAAGAGGCTGGTCTTCAC-3’。β-actin內參引物序列：上游：5’- CATTAAGGAGAAGCTGTGCT-3’；下游：5’-GTTGAAGGTAGTTTCGTGGA-3’。PCR反應條件為95℃預變性5min，94℃ 20s，58.5℃ 20s，72℃ 20s，共40個循環。

1.2.4Western-blot印跡檢測PGC-1α蛋白表達的變化提取各組總蛋白后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束后，轉PVDF膜。取出PVDF膜，對比蛋白質標準質量位置，將所需測定片段和內參片段膜剪下。加入封閉液(5%脫脂牛奶)，置水平搖床于室溫下封閉1h。加入一抗，PGC-1α一抗稀釋比為1∶1000，β-actin稀釋比例為1∶200，置水平搖床于4℃振搖過夜。加入二抗，洗膜。在暗室內用ECL發光法檢測目的條帶，X射線曝光。以β-actin作為內對照。用BandScan5.0軟件進行條帶灰度分析。

2　結果

2.1miR-132細胞轉染效率檢測在轉染率最高的時間點24h時，用熒光顯微鏡下觀察細胞轉染數量，采集該時間點熒光鏡下視野與光鏡下視野對比片(圖1)，細胞的轉染效率達到80%以上，可以進行后續實驗。采用Realtime PCR法進行分析，以確定最佳干預片段(圖2)。

2.2不同時間點各組HUVEC細胞miR-132和PGC-1α表達變化

2.2.1不同時間點各組HUVEC細胞miR-132和PGC-1α mRNA表達HUVEC在低氧培養6h，再恢復常氧繼續培養3、6、12、24h后，Realtime PCR檢測正常組細胞與各時間點細胞miR-132和PGC-1α mRNA的表達變化(圖3、4)：正常組與缺氧培養后復氧3、6、12、24h時miR-132 mRNA相對含量分別為1.0083±0.1324、2.5735±0.3049、1.9073±0.3172、1.5634±0.3419、1.0430±0.1634。復氧3h時miR-132 mRNA表達量最高，隨著復氧時間延長，其表達含量逐步降低。正常組與缺氧培養后復氧3、6、12、24h時PGC-1α mRNA相對含量分別為1.07293±0.1752、13.3957±0.1569、2.8705±0.3616、1.7924±0.2515、1.3616±0.1577，與miR-132 mRNA表達趨勢相似，在復氧3h表達最高，與正常組含量相比，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2.2不同時間點各組HUVEC細胞PGC-1α蛋白表達HUVEC中PGC-1α的蛋白表達水平見圖5：92kD檢測到PGC-1α蛋白表達，43kD處檢測到內參β-actin蛋白表達。缺氧干預后復氧3h時，PGC-1α在蛋白表達水平明顯增高，與正常組蛋白表達水平相比，差異有統計學意義(P<0.01)。隨著復氧時間延長，蛋白表達水平逐漸下調。2.3不同氧條件下各組HUVEC miR-132和PGC-1α表達變化

2.3.1不同氧條件下各組HUVEC細胞miR-132和PGC-1α mRNA表達HUVEC轉染后，在不同氧條件下各組細胞中miR-132和PGC-1α mRNA的表達變化見圖6、7：在常氧下，正常組、陰性對照組、轉染模擬物組、轉染拮抗劑組的miR-132 mRNA的含量為0.9683±0.1154、1.0135±0.1075、3.9581±0.3453、0.2616±0.3244；PGC-1α mRNA的含量為1.0926±0.1591、1.0493±0.1331、3.3232±0.1457、0.5391±0.1612。而在缺氧條件下各組中miR-132 mRNA的含量為2.7660±0.4568、2.6658±0.3494、7.1525±0.4137、0.3187±0.1109；PGC-1α mRNA的含量為：3.4582±0.3456、3.4751±0.2420、5.4544±0.1560、1.8523±0.2826。兩種氧條件下，細胞轉染mir-132-mimic后miR-132 mRNA表達量較其他各組表達量明顯增高。與正常組相比，差異有統計意義(P<0.01)。而在低氧條件下的各組細胞miR-132 mRNA表達量又較其在常氧條件下的表達量有不同程度的上調。

2.3.2不同氧條件各組HUVEC細胞PGC-1α蛋白表達HUVEC轉染mir-132-mimic、anti-mir-132、陰性對照物后分別在常氧和低氧環境中培育后PGC-1α蛋白表達水平見圖8：與PGC-1α mRNA表達趨勢一致，低氧中的表達量明顯高于常氧條件。而轉染mir-132-mimic后PGC-1α蛋白與正常組相比，差異有統計學意義(P<0.01)。

3　討論

圖1細胞轉染效率檢測白光和熒光照片A：人miR-132模擬物轉染；B：人miR-132拮抗劑轉染。

圖2各組HUVEC轉染后miR-132 mRNA表達變化aP<0.01 vs 拮抗劑組。

圖3不同時間點各組HUVEC中miR-132 mRNA表達aP<0.05 vs 正常組。

圖4各時間點組HUVEC中PGC-1α mRNA表達aP<0.05 vs 正常組。

圖5不同時間點各組HUVEC中PGC-1α蛋白表達的Western-blot印跡結果。

圖6不同氧條件下各組HUVEC中miR-132 mRNA表達。

microRNA是近年來發現的存在于各種生物體內具有重要調控作用的一種小分子RNA，與其它調控基因表達的方式如轉錄水平調控或者表觀遺傳修飾相比，miRNAs具有很多優勢。首先，miRNAs相比反式作用因子的調節，能在細胞質中發揮作用。其次，miRNAs的表達水平可在細胞中被迅速上調至幾千個拷貝，相比其它調節方式具有更大的調節潛能。再者，在為細胞隔離外界干擾上，miRNAs介導的反饋調節機制比轉錄抑制因子應對外界刺激更加有效。最后，miRNAs能同時調節多個靶基因，而且通常這些靶基因位于同一信號轉導通路中，使得miRNAs對于調節細胞針對特定刺激的基因表達改變更為有效[6]。

圖7不同氧條件下各組HUVEC 中PGC-1α mRNA表達。

圖8不同氧條件各組HUVEC 中PGC-1α蛋白表達的Western-blot印跡結果。

miR-132可通過作用于新生血管刺激因子，在血管過度增生、血管瘤及腫瘤血管發生中發揮重要作用，對血管新生過程中起調節作用[7]。當血管生長因子信號上調miR-132的表達時，p120RasGAP的表達水平降低，可使Ras持續激活，放大血管生成信號[8]。本研究中，利用人臍靜脈內皮細胞在低氧中培育，之后恢復常氧繼續培育，對細胞模擬一個“缺氧-高氧”狀態，觀察miR-132在新生血管生成過程中表達情況以及對PGC-1α可能存在的調控作用。實驗結果表明：細胞缺氧誘導后，細胞中miR-132mRNA表達水平明顯升高，復氧3h表達量最高，隨著復氧時間延長，其表達量逐漸下調，至24h左右表達量接近正常組狀態。說明缺氧刺激后血管內皮細胞中的miR-132會迅速生成，在新生血管形成過程中起著促進作用，代償組織的缺氧狀態；而當缺氧刺激消除后，miR-132則會降至一個平衡狀態。在我們的前期研究中，發現在缺氧誘導的視網膜新生血管模型小鼠中，小鼠視網膜血管PGC-1α的表達也明顯上調，說明缺氧也可以調控視網膜中PGC-1α的表達。為了檢測miR-132對新生血管及PGC-1α的調控作用，本研究采用脂質體介導細胞轉染mir-132-mimic與anti-mir-132，轉染后將細胞分別置于常氧與低氧中培育，觀察HUVEC中miR-132和PGC-1α的變化及相應的分子機制。常氧組中，未轉染與轉染陰性對照物組細胞中miR-132處于較低表達水平，轉染mir-132-mimic 表現出明顯升高趨勢，而轉染anti-mir-132后出現顯著表達下調。而在低氧組中，轉染mir-132-mimic與anti-mir-132兩者同樣表現出與常氧組中類似的升高與下降的表達趨勢。但在轉染mir-132-mimic、未轉染與轉染陰性對照物組細胞中，miR-132的表達水平要較其在常氧中表達量高。表明在低氧狀態下，轉染mir-132-mimic細胞中miR-132表達量明顯增加，可促進新生血管形成。PGC-1α的表達水平也表現出類似的趨勢，進一步證實了缺氧可誘導血管內皮細胞中PGC-1α的表達增加，PGC-1α對新生血管也存在調控作用，但細胞轉染mir-132-mimic后PGC-1α的表達水平明顯增強，說明在缺氧環境中miR-132對PGC-1α具有更強的調控能力。

總之，本研究揭示了缺氧時HUVEC中miR-132和PGC-1α的表達增強，對細胞轉染mir-132-mimic 后，可以增強細胞中miR-132的表達量，進而進一步刺激PGC-1α的表達上調，進而可促進新生血管形成。本研究為探討miR-132與新生血管及對PGC-1α的可能存在的調節信號通路提供新的思路，為進一步的研究提供實驗基礎。

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3管娣，劉春穎，陳晨，等.MiR-132抑制腫瘤轉移.生物化學與生物物理進展2013；40(2): 159-164

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5Zhang L,Jiang J,Xia X.Suppression of retinal neovascularization by siRNA targeting PGC-1α.Int J Mol Med 2014；33(6):1523-1530

6Anand S.A brief primer on microRNAs and their roles in angiogenesis.Vasc Cell 2013；5(1):2

7楊子巖,晏賢春,趙星成,等.微小RNAs與新生血管形成.心臟雜志 2015;27(1):102-109

8Anand S,Cheresh DA.Emerging role of Micro-RNAs in the regulation of angiogenesis.Genes Cancer 2011;2(12):1134-1138

Effect of regulation in human umbilical vein endothelia cells treated by microRNA-132

Li-Xin Zhang,Li-Juan Tao

Li-Juan Tao.Department of Ophthalmology,Hunan Children’s Hospital,Changsha 410007,Hunan Province,China.wupoxin@suhu.com

2016-04-28Accepted：2016-09-07

microRNA-132; peroxisome-proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α; human umbilical vein endothelial cells; hypoxia

(410007)中國湖南省長沙市，湖南省兒童醫院眼科

張櫪心，女，畢業于中南大學湘雅醫院眼科，博士，主治醫師，研究方向：小兒眼病、眼底病。

陶利娟，女，畢業于南華大學，碩士，主任醫師，主任，研究方向：斜弱視、屈光、眼保健.wupoxin@suhu.com

2016-04-28

2016-09-07

Zhang LX,Tao LJ.Effect of regulation in HUVEC treated by microRNA-132.Guoji Yanke Zazhi(Int Eye Sci) 2016;16(10):1820-1823

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.10.08