Bmi-1在口腔鱗癌組織中的表達(dá)及意義*

劉庭庭， 馬　洪， 段曉峰

(貴州醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)系， 貴州 貴陽　550004)

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Bmi-1在口腔鱗癌組織中的表達(dá)及意義*

劉庭庭， 馬洪**， 段曉峰

(貴州醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)系， 貴州 貴陽550004)

目的： 探討B(tài)mi-1基因在口腔鱗癌組織中的表達(dá)及意義。方法： 收集口腔鱗癌(OSCC)患者手術(shù)切除新鮮標(biāo)本30例作為OSCC組，癌旁0.5 cm外正常組織及正常體檢者的口腔黏膜組織共30例作為正常對照組，免疫組織化學(xué)染色SP法檢測兩組組織中Bmi-1蛋白的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)(QPCR)檢測Bmi-1 mRNA的表達(dá)，比較不同臨床理特征OSCC患者Bmi-1的表達(dá)差異。結(jié)果： OSCC組織中，Bmi-1蛋白和mRNA的表達(dá)明顯高于正常對照組；在OSCC組織中，中低分化的OSCC組織的Bmi-1蛋白和mRNA表達(dá)高于高分化OSCC組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Bmi-1表達(dá)與患者年齡、性別無關(guān)(P>0.05)。結(jié)論： Bmi-1基因檢測可作為OSCC的輔助診斷指標(biāo)之一。

Bmi-1； 基因； 口腔腫瘤； 癌,鱗狀細(xì)胞； 免疫組織化學(xué)

[Abstract]Objective: To explore the Bmi-1 gene expression and clinical significance in oral squamous carcinoma(OSCC) tissues. Methods: Fresh tissue samples of 30 patients with oral squamous cell carcinomas were collected as OSCC group, while 30 cases of 0.5 cm normal tissue adjacent to carcinoma and normal physical examination were taken as the normal control group. The expression of Bmi-1 protein in the two groups was detected by immunohistochemistry SP method, and the expression of mRNA Bmi-1 was detected by real-time quantitative PCR. Results: The expression of Bmi-1 protein and mRNA in OSCC tissue were significantly higher than those in normal control group. In OSCC tissues, the expression of Bmi-1 protein and mRNA in the low and middle differentiated OSCC tissues were higher than those in the highly differentiated OSCC tissues, and the difference was statistically significant (P<0.05). BMI-1 expression was not related to patient's age and sex. Conclusion: Bmi-1 gene detection can be used as one of the auxiliary diagnostic indicators of oral squamous cell carcinomas.

[Key words]Bmi-1; gene; mouth neoplasms; carcinoma; squamous cell，immunohistochemistry

PcG蛋白-多梳家族蛋白(polycomb groupprotein)是一類在染色質(zhì)水平抑制靶基因轉(zhuǎn)錄的蛋白，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞記憶、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和腫瘤形成等過程中起到非常重要的作用。B細(xì)胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒整合位點(diǎn)(B-cell-speciifc moloney murine leukemia virus integration site 1，Bmi-1)是目前研究中最深入的哺乳動(dòng)物PcG家族成員。近年來，越來越多的證據(jù)表明 ，Bmi-1在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。Bmi-1在很多腫瘤中處于高表達(dá)的狀態(tài)，如髓母細(xì)胞瘤[1]、非霍奇金淋巴瘤[2]、肝癌[3]、結(jié)直腸癌[4]、乳腺癌[5]等,本研究通過檢測口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)組織中Bmi-1的表達(dá)，并比較OSCC不同臨床病理特征患者Bmi-1表達(dá)的差異，為OSCC的臨床早期診斷、生物蛋白靶向治療及預(yù)后監(jiān)測判斷提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來源2012年9月～2015年3月手術(shù)切除OSCC患者30例作為OSCC組，男22例，女8例，高分化22例、中低分化8例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5例。術(shù)前未采用任何針對腫瘤的治療(放療、化療等)，術(shù)中用尖刀切取標(biāo)本后，鹽水沖洗，置-80 ℃冰箱保存；術(shù)后常規(guī)病理檢查確診為OSCC。選擇口腔黏膜正常組織及癌旁0.5 cm正常組織(經(jīng)病理證實(shí)無癌累及)共30例作為正常對照組。

1.1.2主要試劑及設(shè)備小鼠抗人Bmi-1單克隆抗體(Abcam公司)，SP免疫組化二抗試劑盒-通用型、蘇木素及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，mRNA抽提試劑盒Dynabeads ?mRNA DIRECTTM、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit和PCR擴(kuò)增試劑 Light Cycler?480 SYBR Green ⅠMaster購自Roche公司，CFX connect Real Time System PCR儀。

1.2方法

1.2.1Bmi-1蛋白表達(dá)采用免疫組織化學(xué)染色SP法，組織蠟塊切成厚5 μm連續(xù)切片，脫蠟水化后，3%去離子過氧化氫液封閉內(nèi)源性過氧化物酶，高壓鍋波熱處理修復(fù)抗原，正常山羊血清封閉特異性抗原，加入Bmi-1一抗工作液、4 ℃孵育過夜，加入生物素二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固；PBS代替一抗，做陰性對照，實(shí)驗(yàn)程序嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。各組切片在光鏡下觀察、評分及病理圖像采集[6-7]，每個(gè)樣本觀察 10 個(gè)高倍鏡視野。根據(jù)陽性強(qiáng)度及面積記分，無色記0分，淡黃色記1分，棕黃色及以上記2分；著色面積<1/3、1/3～2/3和>2/3 分別為0、1和2 分；0～1 分為陰性，2～3 分為陽性(+)，4 分為強(qiáng)陽性(++)。

1.2.2Bmi-1 mRNA表達(dá)采用實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)(real-time quantitative PCR detecting system，QPCR)，利用磁珠法提取組織mRNA，從存儲在RNALATER試劑(-80 ℃)的組織中切取1～2 mm3組織，加入蛋白溶解酶K，55 ℃恒溫箱中消化完全后，加入40 μL Dynabeads dT25，置搖床10 min，立即放入磁場中，移除上清液并用BufferA/B液順次洗滌。加入Tris-HCL，溶解磁珠并放入80 ℃恒溫箱2 min，將收集來的大約13 μL mRNA(在Tris-HCL中的)直接加入事先準(zhǔn)備好的7.5 μL cDNA Synthesis Master Mis中。將樣品放入熱循環(huán)儀中，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min，-20 ℃儲存?zhèn)溆?。將上述合成的cDNA上樣至10 μL反應(yīng)體系：SYBR Green ⅠMaster 5.0 μL，上下游引物 4.0 μL，模板1 μL，用CFX connect Real Time System PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 10 s，退火65 ℃ 30 s，共64個(gè)循環(huán)[8]。每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔，取CT平均值，采用相對定量法分析結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，率的比較采用四格表資料的χ2檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布資料間的比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Bmi-1的蛋白表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示Bmi-1主要著色于細(xì)胞核內(nèi)，為棕黃色染色顆粒，在正常組織中幾乎無陽性表達(dá)，見圖1。OSCC組中，Bmi-1蛋白的陽性表達(dá)率均高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。臨床病理分析顯示，Bmi-1的表達(dá)隨著腫瘤體積增大而升高，陽性率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著臨床分期的進(jìn)展，Bmi-1蛋白在OSCC組織中的表達(dá)也升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；OSCC組織中，Bmi-1蛋白表達(dá)與患者年齡、性別無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

正?？谇火つぁ　　　　　　　　　?　　　　　　OSCC黏膜圖1　正?？谇火つぜ癘SCC組織中Bmi-1蛋白表達(dá)(SP法, ×100)Fig.1　Bmi-1 protein expression in tissue

分組 Bmi-1蛋白表達(dá)n-+++ 陽性率(%)χ2P正常對照組30217230.017.38<0.01OSCC組 305151083.3

2.2Bmi-1 mRNA表達(dá)

30例OSCC組織中Bmi-1 mRNA表達(dá)(平均秩和45.50)高于正常對照組(平均秩和15.50),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-6.666，P<0.01)。在OSCC組織中，Bmi-1 mRNA的表達(dá)隨著腫瘤體積增大而升高，中低分化組表達(dá)高于高分化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Bmi-1 mRNA表達(dá)與患者年齡、性別無關(guān),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

3　討論

已知在多種腫瘤中存在一類具有自我更新和多向分化潛能的腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)。Bmi-1與CSC的自我更新及腫瘤的放化療敏感性都有關(guān)系，降低 Bmi-1的表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡和衰老,并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對放化療的敏感性，Bmi-1可能為腫瘤治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，Bmi-1的特異性表面標(biāo)志用于頭頸部鱗癌干細(xì)胞的檢測和治療方案的制定，能使健康人類口腔角質(zhì)細(xì)胞的壽命延長[11-12]，提示Bmi-1在鱗癌組織發(fā)生、發(fā)展及治療中起重要作用。本課題通過對OSCC組織中Bmi-1表達(dá)情況進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在OSCC患者口腔黏膜中Bmi-1蛋白的表達(dá)主要在基底細(xì)胞層，陽性表達(dá)率為83.3%，高于文獻(xiàn)報(bào)道的79.0%[13]，這可能與樣本的數(shù)量有關(guān)；同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在OSCC組織中Bmi-1基因的表達(dá)高于正常對照組，且Bmi-1的高表達(dá)與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān)，提示Bmi-1在口腔鱗癌發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移過程中也起重要作用，其發(fā)生機(jī)制需進(jìn)一步研究。綜上所述，Bmi-1基因檢測可作為OSCC的輔助診斷指標(biāo)之一，研究Bmi-1在OSCC中的表達(dá)與OSCC的相關(guān)性及協(xié)同作用，可為OSCC的臨床診斷、預(yù)防、生物蛋白靶向治療及預(yù)后監(jiān)測判斷等提供理論基礎(chǔ)。

表2　不同臨床病理參數(shù)OSCC患者口腔黏膜組織Bmi-1蛋白表達(dá)

(1)同病理參數(shù)下的各指標(biāo)比較，P<0.05

表3　不同臨床特征OSCC患者口腔黏膜Bmi-1mRNA表達(dá)比較

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(2016-02-05收稿，2016-05-15修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華

Bmi-1 Expression and its Clinical Significance in Oral Squamous Carcinoma Tissues

LIU Tingting, MA Hong, DUAN Xiaofeng

(DepartmentofOralMedicine,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

貴陽市科技局社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目科研基金一項(xiàng)[筑科合同(2013103)]

Email:mahong1966@126.com

R739.8

A

1000-2707(2016)08-0942-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.08.019

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