諾氟沙星對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性作用及對(duì)TGF-β1的影響

王冬梅谷從友劉銅張瓊宇李培胡曉軍

（1.皖北衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院人體解剖學(xué)及組織胚胎學(xué)教研室，宿州 234000；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，蚌埠 233030；3.蚌埠醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，蚌埠 233030；4.永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，永州 425100）

諾氟沙星對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性作用及對(duì)TGF-β1的影響

王冬梅1谷從友2劉銅3張瓊宇4李培4胡曉軍4

（1.皖北衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院人體解剖學(xué)及組織胚胎學(xué)教研室，宿州 234000；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，蚌埠 233030；3.蚌埠醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，蚌埠 233030；4.永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，永州 425100）

旨在通過(guò)觀察不同濃度諾氟沙星對(duì)斑馬魚胚胎不同發(fā)育時(shí)期的毒性作用，以及對(duì)TGF-β1基因表達(dá)的影響。配制諾氟沙星濃度為0、10、20、40 μmol/L，將斑馬魚胚胎暴露在上述濃度的諾氟沙星中。觀察在胚胎不同發(fā)育時(shí)期，諾氟沙星對(duì)斑馬魚脊柱彎曲、心包囊腫、卵黃囊腫和死亡率的影響，以及使用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）檢測(cè)其對(duì)TGF-β1基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，諾氟沙星對(duì)斑馬魚的胚胎發(fā)育有明顯影響，主要表現(xiàn)在脊柱彎曲、心包囊腫和卵黃囊腫，隨著諾氟沙星暴露濃度的增大，胚胎的發(fā)育延遲，孵化時(shí)間延長(zhǎng)，胚胎死亡率增加；當(dāng)諾氟沙星暴露濃度為40 μmol/L時(shí)，96 hpf的胚胎死亡率達(dá)到76.45%；與正常狀態(tài)相比，暴露于不同濃度諾氟沙星的斑馬魚胚胎中TGF-β1基因的mRNA表達(dá)隨發(fā)育時(shí)間延長(zhǎng)而增加趨勢(shì)減緩。說(shuō)明諾氟沙星對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的致畸作用與致死作用有顯著的影響。提示水體中殘留的諾氟沙星對(duì)魚類的生殖與發(fā)育具有潛在的危害。

諾氟沙星；斑馬魚；胚胎；致畸；致死；TGF-β1

長(zhǎng)期以來(lái)，抗生素被大量地用于人和動(dòng)物疾病的治療及各類動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中。由于抗生素具有不能被人和動(dòng)物機(jī)體完全代謝的特性，大多以原形和活性代謝產(chǎn)物的形式通過(guò)病人和畜禽的糞、尿液直接排入環(huán)境，現(xiàn)有研究表明，在世界各國(guó)的各類水體中均檢測(cè)出多種類、不同濃度的抗生素。中國(guó)抗生素濫用現(xiàn)象尤為嚴(yán)重，已成為威脅人們健康和生存的隱患，抗生素污染已成為不可忽視的環(huán)境問(wèn)題［1］。諾氟沙星（Norfloxacin）是第三代喹諾酮類的抗生素藥物，對(duì)多種革蘭氏陰性桿菌和部分革蘭氏陽(yáng)性球菌具有殺菌作用。通過(guò)直接作用于細(xì)菌的核酸，干擾細(xì)菌DNA合成，破壞核酸的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，從而影響細(xì)菌的代謝與增殖。由于諾氟沙星的抗菌譜廣，抗菌效用強(qiáng)，療效良好，因此在國(guó)內(nèi)廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌性疾病的預(yù)防。隨著喹諾酮類藥物的使用日益廣泛，其不良反應(yīng)及毒副反應(yīng)也逐漸顯現(xiàn)。有學(xué)者認(rèn)為喹諾酮類藥物均存在潛在的心臟毒性，而有些喹諾酮類藥物還具有軟骨毒性、消化系統(tǒng)不良反應(yīng)及肝腎功能損傷等作用［2］。生物處于胚胎時(shí)期暴露在污染環(huán)境中對(duì)其發(fā)育具有嚴(yán)重的危害，尤其對(duì)脊椎動(dòng)物的危害作用尤甚，因其胚胎早期對(duì)污染物具有非常敏感的毒理效應(yīng)，而魚胚胎比成魚對(duì)環(huán)境的污染源更加敏感［3］。

斑馬魚（Dario rerio，zebrafish）屬于硬骨魚類輻鰭綱鯉形目鯉科鮐屬，是國(guó)際經(jīng)濟(jì)協(xié)作和發(fā)展組織（Organization for economic co-operation and development，OECD）確定的模式生物，其基因組測(cè)序已基本完成，與人類基因組的同源性高達(dá)87%［4］。斑馬魚生活周期短，產(chǎn)卵量高且胚胎透明、體外發(fā)育易于觀察。此外，斑馬魚胚胎發(fā)育階段通常對(duì)毒性作用敏感，已被廣泛應(yīng)用于評(píng)估化學(xué)污染物的毒性成為生態(tài)毒理學(xué)研究的一種重要方法［5］。Yoder等［6］研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚具有與人類白蛋白表面受體基因簇同源序列。因此，在斑馬魚中進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果對(duì)人類具有重要的參考價(jià)值。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（Tranforming growth factor-β，TGF-β）是由多種結(jié)構(gòu)相關(guān)的多肽生長(zhǎng)因子組成，具有免疫調(diào)節(jié)，細(xì)胞的生長(zhǎng)分化，原始細(xì)胞遷移以及組織損傷修復(fù)等作用［7］。TGF-β信號(hào)途徑對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育具有多方面的調(diào)控作用，在脊椎動(dòng)物的胚胎發(fā)育中參與胚胎內(nèi)胚層和中胚層的形成。諾氟沙星的對(duì)胚胎致畸作用通過(guò)對(duì)TGF-β1基因表達(dá)的差異顯示出來(lái)。本實(shí)驗(yàn)采用斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，觀察不同濃度諾氟沙星暴露濃度對(duì)斑馬魚胚胎的不同發(fā)育時(shí)期的致畸作用和致死作用，以及對(duì)TGF-β1基因表達(dá)的影響，為確認(rèn)水體中諾氟沙星在對(duì)胚胎致畸作用及其分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 諾氟沙星購(gòu)自浙江華義醫(yī)藥有限公司，純度大于98%，用0.1%鹽酸溶液溶解制備為1mmol/L的儲(chǔ)備液；Holtfreter培養(yǎng)液配制：每升水里添加0.025 g碳酸氫鈉，0.05 g氯化鉀，3.5 g氯化鈉，0.l g氯化鈣，溶解后調(diào)pH至7.2；Hank’s培養(yǎng)液配制參考文獻(xiàn)［6］；其他試劑為國(guó)內(nèi)分析純。

1.1.2 動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)魚種屬于AB品系斑馬魚。斑馬魚養(yǎng)殖于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，水溫26-28℃，pH值為6.8-7.5，電導(dǎo)率為880±20 μs/cm，飼養(yǎng)用水經(jīng)過(guò)系統(tǒng)曝氣過(guò)濾，光照晝夜比為14 h/10 h，以新孵化的豐年蟲喂食，每日早晚一次。在交配前一天，挑選成年個(gè)體較大，游動(dòng)形態(tài)正常的健康斑馬魚，以雌雄數(shù)目1∶2的比例置于預(yù)先加入新鮮Holtfreter液的孵化器，孵化器內(nèi)加入能讓魚卵通過(guò)的紗網(wǎng)。成魚受光刺激后開(kāi)始產(chǎn)卵，收集胚胎后經(jīng)過(guò)消毒清洗，初步挑選后將胚胎置于10%Hank’s培養(yǎng)液中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待胚胎生長(zhǎng)至6 hpf時(shí)，棄去未受精的魚卵，剩下的受精胚胎進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 諾氟沙星的斑馬魚胚胎暴露 參考OECD標(biāo)準(zhǔn)，取6孔板，每孔放置10顆6 hpf的受精卵，加入5 mL Hank’s培養(yǎng)液。通過(guò)胚胎預(yù)實(shí)驗(yàn)確定暴露的濃度范圍。用曝氣自來(lái)水稀釋諾氟沙星儲(chǔ)備液為0、10、20和40 μmol/L，助溶溶液體積控制為0.1%，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行。將6孔板置于培養(yǎng)箱中，在光照晝夜比為14 h/10 h的光周期下進(jìn)行培養(yǎng)，用顯微鏡觀察胚胎形態(tài)，直至96 hpf的胚胎發(fā)育情況。每天更換50%培養(yǎng)液，并保持藥物濃度穩(wěn)定。觀察指標(biāo)：胚胎死亡、脊柱彎曲、心包囊腫和卵黃囊腫，并進(jìn)行記錄。以毒理學(xué)終點(diǎn)的出現(xiàn)作為觀察胚胎發(fā)育的毒性，見(jiàn)表1。

表1 斑馬魚胚胎各階段的毒理學(xué)終點(diǎn)

1.2.2 qPCR檢測(cè)TGF-β1基因在斑馬魚胚胎發(fā)育中的表達(dá) 收集經(jīng)各濃度諾氟沙星處理的處于24、48、72和96 hpf斑馬魚正常胚胎各20顆，按照Trizol說(shuō)明書進(jìn)行操作，提取總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。以β-actin作為參照。反應(yīng)條件為：94℃ 30 s；57℃ 30 s；74℃ 1 min；共35個(gè)循環(huán)。TGF-β1引物：上游5'-CGTCTTCCAGCAAGCTCAGA-3'，下游5'-TCCGAAGACGCAATTCTGCT-3'；β-actin引物：上游5'-GATGCGGAAACTGGCAAAGG-3'，下游5'-GAGGGCAAAGTGGTAAACGC-3'。反應(yīng)結(jié)束后，標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增曲線有PCR儀器自動(dòng)生成，將TGF-β1與內(nèi)參基因進(jìn)行比較，得出目的基因相對(duì)表達(dá)量的變化，所得結(jié)果直接在熒光定量操作軟件中進(jìn)行分析比較。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差分析采用單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 諾氟沙星對(duì)斑馬魚胚胎的致畸作用

如圖1所示，隨著諾氟沙星濃度的增大，胚胎的發(fā)育延遲，孵化時(shí)間延長(zhǎng)，胚胎細(xì)胞色素沉淀。斑馬魚胚胎在低濃度暴露下48 hpf時(shí)已出現(xiàn)脊柱彎曲現(xiàn)象，隨著暴露濃度增加，脊柱彎曲現(xiàn)象增加；在20 μmol/L濃度暴露下96 hpf時(shí)出現(xiàn)卵黃囊腫，而40 μmol/L濃度暴露下48 hpf已出現(xiàn)卵黃囊腫；40μmol/L濃度暴露下96 hpf時(shí)出現(xiàn)心包囊腫。觀察96 hpf時(shí)不同諾氟沙星濃度暴露下對(duì)脊柱彎曲的影響（圖2-A），隨著諾氟沙星濃度增加，脊柱彎曲增加趨勢(shì)明顯；斑馬魚胚胎卵黃囊腫的出現(xiàn)率如圖2-B。在不同諾氟沙星濃度暴露下，斑馬魚胚胎的發(fā)育均不正常。其脊柱彎曲與卵黃囊腫的發(fā)生率與諾氟沙星的濃度是正相關(guān)的量效關(guān)系。

圖1 不同濃度諾氟沙星暴露下對(duì)斑馬魚胚胎的影響

圖2 諾氟沙星對(duì)斑馬魚胚胎96 hpf時(shí)脊柱彎曲（A）和卵黃囊腫（B）的影響

2.2 諾氟沙星對(duì)斑馬魚胚胎的致死作用

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至96 hpf時(shí)，諾氟沙星各暴露濃度下的斑馬魚胚胎均有一定的死亡（圖3）。隨著諾氟沙星濃度的增加，胚胎的死亡率逐漸增高。在諾氟沙星暴露濃度為40 μmol/L時(shí)，96 hpf的胚胎死亡率達(dá)52.16%，表明諾氟沙星的濃度與斑馬魚胚胎的死亡率具有正相關(guān)的量效關(guān)系。

圖3 諾氟沙星對(duì)斑馬魚胚胎96 hpf死亡率的影響

2.3 諾氟沙星對(duì)TGF-β1基因在斑馬魚胚胎發(fā)育中的表達(dá)

采用qPCR方法檢測(cè)在不同諾氟沙星暴露濃度下，斑馬魚胚胎中TGF-β1基因的表達(dá)情況。TGF-β1標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.996，說(shuō)明定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠，標(biāo)準(zhǔn)曲線良好（圖4）。系統(tǒng)以前8個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為閥值，根據(jù)熒光信號(hào)的變化規(guī)律自動(dòng)生成擴(kuò)增曲線（圖5）。如表2所示，未加入諾氟沙星的斑馬魚胚胎中可檢測(cè)到TGF-β1基因，隨胚胎發(fā)育而其表達(dá)加強(qiáng)；在經(jīng)過(guò)諾氟沙星暴露后，TGF-β1基因的表達(dá)與未加入諾氟沙星的胚胎相比有所下降，但隨胚胎發(fā)育其表達(dá)仍呈上升趨勢(shì)。

圖4 TGF-β1定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖5 TGF-β1在斑馬魚胚胎不同發(fā)育階段（0 μmol/L諾氟沙星）的擴(kuò)增曲線圖

3 討論

生物對(duì)環(huán)境因素的改變非常靈敏，當(dāng)環(huán)境改變后生物的相應(yīng)生理活動(dòng)狀態(tài)的改變可作為評(píng)估化合物毒性和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要指標(biāo)之一。斑馬魚作為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）河水毒性試驗(yàn)的推薦魚種，斑馬魚成為僅次于小鼠的第二優(yōu)先脊椎模式動(dòng)物［8］。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者進(jìn)行了酒精等物質(zhì)對(duì)斑馬魚神經(jīng)影響的實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)。Fenske等［9］研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)分泌干擾物（Endocrine disrupting chemicals，EDCs）會(huì)干擾斑馬魚的雌激素受體而影響內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)。

表2 諾氟沙星對(duì)TGF-β1基因在斑馬魚胚胎不同發(fā)育階段的表達(dá)

魚類的TGF-β亞家族具有TGF-β2、TGF-β2、TGF-β3和TGF-β6四種異構(gòu)體，其中TGF-β1是表達(dá)最廣泛的亞型。斑馬魚成魚的TGF-β1大量分布在胸腺、頭腎和外周血淋巴細(xì)胞中，主要參與生殖和免疫調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在正常斑馬魚胚胎中有表達(dá)。隨著正常胚胎發(fā)育，TGF-β1基因的表達(dá)逐漸升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［10］，斑馬魚早期胚胎TGF-β1基因的mRNA表達(dá)水平隨胚胎生長(zhǎng)發(fā)育而逐漸增加。暴露在不同濃度的諾氟沙星中，斑馬魚胚胎在不同發(fā)育時(shí)期的TGF-β1基因的mRNA表達(dá)顯著低于未加入諾氟沙星的胚胎。而TGF-β1基因的低表達(dá)對(duì)于卵黃的血管形成和造血功能有顯著影響，產(chǎn)生卵黃缺血后，極易造成胚胎的死亡［11］。提示TGF-β1基因的表達(dá)異常，可能對(duì)斑馬魚胚胎具有致畸作用或致死作用；諾氟沙星能夠抑制斑馬魚胚胎中TGF-β1基因的表達(dá)，從而影響胚胎的發(fā)育。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一定濃度諾氟沙星對(duì)斑馬魚胚胎具有致畸作用及致死作用；諾氟沙星對(duì)TGF-β1參與斑馬魚胚胎發(fā)育調(diào)控具有抑制作用。隨著藥物附著在養(yǎng)殖用水中排放至土壤或進(jìn)入水體中，抗生素逐漸成為水資源的安全使用的巨大威脅，由于抗生素與其他農(nóng)藥和有機(jī)物不同，盡管在水體中濃度較低，但對(duì)環(huán)境與人類的危害巨大，可以通過(guò)作物吸收積累而進(jìn)入人類和動(dòng)物的食物鏈，繼而在食物鏈中富集，對(duì)人體健康造成巨大的危害。因此，我們應(yīng)引起水體中抗生素污染的重視。

4 結(jié)論

本研究直接通過(guò)諾氟沙星的斑馬魚胚胎暴露實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，諾氟沙星對(duì)斑馬魚的胚胎發(fā)育有明顯的致畸和致死作用；通過(guò)qPCR檢測(cè)TGF-β1基因在斑馬魚胚胎發(fā)育中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，諾氟沙星降低對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育具有調(diào)控作用的TGF-β1基因表達(dá)。

［1］Faria M， López MA， Fernández-Sanjuan M， et al. Comparative toxicity of single and combined mixtures of selected pollutants among larval stages of the native freshwater mussels（Unio elongatulus） and the invasive zebra mussel（Dreissena polymorpha）［J］. Science of the Total Environment， 2010， 408（12）：2452-2458.

［2］梁惜梅. 諾氟沙星和三氯生對(duì)劍尾魚的毒性效應(yīng)［D］. 廣州：暨南大學(xué)， 2010.

［3］Bechmann RK， Larsen BK， Taban IC， et al. Chronic exposure of adults and embryos of Pandalus borealis to oil causes PAH accumulation， initiation of biomarker responses and an increase in larval mortality［J］. Marine Pollution Bulletin， 2010， 60（11）：2087-2098.

［4］Tsang M. Zebrafish：a tool for chemical screens［J］. Birth Defects Res C Embryo Today， 2010， 90（3）：185-192.

［5］毛晶琳. 萘普生的斑馬魚胚胎發(fā)育毒性及其臭氧降解特性研究［D］. 杭州：浙江工業(yè)大學(xué)， 2013.

［6］Yoder JA， Mueller MG， Wei S. et al. Immune-type receptor genes in zebrafish share genetic and functional properties with genes encoded by the mammalian leukocyte receptor cluster［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2001， 98（12）：6771-6776.

［7］ Wu MY， Hill CS. TGF-β Superfamily signaling in embryonic development and homeostasis［J］. Developmental Cell， 2009， 16（3）：329-343.

［8］Lammer E， Carr GJ， Wendler K， et al. Is the fish embryo toxicity test（FET）with the zebrafish（Danio rerio）a potential alternative for the fish acute toxicity test？［J］. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol， 2009， 149（2）：196-209.

［9］Fenske M， Segner H. Aromatase modulation alters gonadal differentiation in developing zebrafish（Danio rerio）［J］. Aquatic Toxicology， 2004， 67（2）：105-126.

［10］佟靜媛， 柳星峰， 賈順姬. Rbb4l 促進(jìn)TGF-β/Nodal信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和斑馬魚胚胎的背部發(fā)育［J］. 遺傳， 2013， 35（4）：477-487.

［11］候少豐， 李艷麗， 徐功玉， 等. 斑馬魚胚胎發(fā)育過(guò)程中TGF-β1基因的表達(dá)特征分析［J］. 水生生物學(xué)報(bào)， 2014， 38（6）：1054-1061.

（責(zé)任編輯李楠）

The Deleterious Effects of Norfloxacin on Zebrafish Embryonic Development and TGF-β1 Expression

WANG Dong-mei1GU Cong-you2LIU Tong3ZHANG Qiong-yu4LI Pei4HU Xiao-jun4
（1. Department of Human Anatomy and Histoembryology，North Anhui Health Vocational College，Shuzhou 234000；2. Department of Pathology，Bengbu Medical College，Bengbu 233030；3. Department of Histology and Embryology；Bengbu Medical College，Bengbu 233030；4. Faculty of Basic Medicine，Yongzhou Vocational Technical College；Yongzhou 425100）

The aim of this work is to investigate the deleterious effects of norfloxacin on zebrafish embryonic development in different periods， and determine its effects on TGF-β1 expression. Zebrafish embryos were exposed to different concentrations of norfloxacin（0， 10，20， and 40 μmol/L）. The effects of norfloxacin on spinal curvature， pericardial cyst， yolk edema and mortality of zebrafishes in the different developmental periods were observed. Furthermore， the mRNA level of TGF-β1 was examined by qPCR. The results showed that norfloxacin had significantly deleterious effects on zebrafish embryonic development， as mainly evidenced by spinal curvature， pericardial cyst and yolk edema. With the increase of concentration of norfloxacin， embryonic development was delayed， and the hatch period and mortality increased. The mortality rate of zebrafish embryos at 96 hpf re ached 76.46% after exposure to 40 μmol/L norfloxacin. Moreover， comparing with control group，the increase trend on mRNA level of TGF-β1 in zebrafish embryo exposing to different dose of norfloxacin slowed down with the prolonging of development time. Conclusively， norfloxacin has teratogenic and lethal effects on zebrafish embryonic development， suggesting norfloxacin residue in water system has serious latent dangers to the reproduction and development of fish.

norfloxacin；zebrafish；embryos；teratogenesis；lethal；TGF-β1

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.028

2015-08-09

湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（13C970）

王冬梅，女，副教授，研究方向：人體解剖學(xué)及組織胚胎學(xué)教學(xué)與科研；E-mail：506346640@qq.com

張瓊宇，男，博士，講師，研究方向：發(fā)育生物學(xué)；E-mail：drwuzurong@126.com