趨化因子受體4在卵巢上皮性癌中的表達及意義*

陳國慶， 王興新， 訾　聃

(1.貴州醫科大學附院 婦產科， 貴州 貴陽　550004； 2.威寧縣人民醫院 婦產科， 貴州 威寧　553100 )

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趨化因子受體4在卵巢上皮性癌中的表達及意義*

陳國慶1，2**， 王興新2， 訾聃1***

(1.貴州醫科大學附院 婦產科， 貴州 貴陽550004； 2.威寧縣人民醫院 婦產科， 貴州 威寧553100 )

目的： 觀察卵巢上皮性癌(EOC)中趨化因子受體4(CXCR4)、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、表皮生長因子受體(EGFR)和增殖細胞核抗原(Ki-67)的表達及其與臨床病理特征間的關系。方法： 應用免疫組化法檢測40例卵巢上皮性癌(EOC組)組織和10例卵巢良性腫瘤組織(對照組)中CXCR4陽性表達率，同時檢測EOC患者癌組織中Cyclin D1、EGFR和Ki-67表達水平，分析CXCR4、Cyclin D1、EGFR及Ki-67在EOC患者癌組織中的陽性表達率與患者年齡、組織學分級、是否有淋巴轉移及TNM分期的關系，采用Spearman秩相關分析EOC患者癌組織中CXCR4表達與EGFR、Cyclin D1及Ki-67表達的相關性。結果： 對照組中CXCR4的陽性表達率(20%)低于EOC組(57.50%)，差異有統計學意義(P<0.05)；EOC患者癌組織中的CXCR4的陽性表達率與EOC患者臨床分期、組織學分級及有無淋巴轉移有關(P<0.05)，與年齡無關(P>0.05)；EOC患者中Cyclin D1陽性表達率與臨床分期、組織學分級有關(P<0.05)，而與年齡、有無淋巴結轉移無關(P>0.05)；EGFR與Ki-67的過表達率與臨床分期有關(P<0.05)，而與年齡、組織學分級及有無淋巴轉移無關(P>0.05)；EOC患者癌組織中CXCR4的陽性表達與Cyclin D1的陽性表達、EGFR的過表達及Ki-67的過表達之間呈現正相關性(r=0.535、0.506、0.490，P<0.05)。結論： CXCR4、Cyclin D1、EGFR和Ki-67的聯合檢測對EOC的發生、預后判斷、治療選擇有一定的參考意義。

卵巢腫瘤,上皮性； 趨化因子受體4； 細胞周期蛋白D1； 表皮生長因子受體； 免疫組織化學； 染色法

卵巢癌的發病率居婦科腫瘤第3位，病死率居第1位，而卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer，EOC)在卵巢癌中所占比例約為85%～90%[1-2]。目前，卵巢癌的發病機制仍不清楚，可能是多因子共同作用的結果, 有研究發現，趨化因子受體4(chemokine receptor type 4,CXCR4)在卵巢癌中高表達，可促進卵巢癌細胞增殖、侵襲和腫瘤血管生成；細胞周期蛋白D1(cell cycle protein D1,Cyclin D1)是細胞周期調節因子，可以促進腫瘤細胞的增殖、粘附、侵襲、轉移和腫瘤血管生成，還能抑制腫瘤細胞的凋亡；表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)異常可導致卵巢出現惡變，而增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，Ki-67)被認為是一種增殖細胞核抗原，在多種惡性腫瘤中均有表達及過表達，且Cyclin D1及EGFR在EOC中的表達與臨床分期及細胞分化程度有關[3-6]，本文應用免疫組織化學方法檢測EOC 組織中CXCR4、、Cyclin D1、EGFR及Ki-67表達，探討不同病理學參數下上述指標的變化及相關性，報告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料與試劑

2008年2月～2012年12月經手術確診的EOC患者40例，其中黏液性腺癌7例，漿液性腺癌33例，取其手術蠟塊標本作為觀察組，另選取同期手術的卵巢良性腫瘤10例為對照組，其中漿液性囊腺瘤3例，黏液性囊腺瘤7例。兩組患者臨床資料完整，術前未接受過放、化療及免疫治療，手術標本均送至病理科確診。觀察組16～83歲，平均(49.37±10.25)歲；組織學分級：低分化12例，中分化24例，高分化4例；FIGO(2009年)分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期6例，Ⅲ期18例，Ⅳ期2例，7例有淋巴結轉移；對照組17～69歲，平均(48.92±10.31)歲。兔抗人CXCR4多克隆抗體購自武漢博士德生物公司，兔抗人EGFR單克隆抗體購自上海基因公司， Cyclin D1兔抗人單克隆抗體、Ki-67鼠抗人單克隆抗體及SP免疫組化相關試劑盒均購自福州邁新生物技術有限公司。

1.2方法

采用SP免疫組織化學法，將選好的蠟塊，3 μm連續切片，每例切4張，取其中一張做蘇木素-伊紅(HE)染色，其余做免疫組織化學染色。一抗工作濃度根據預實驗結果調整，CXCR4為1∶150，Ki-67、Cyclin Dl及EGFR均為1∶100，對照組選用卵巢良性腫瘤。免疫組化染色程序嚴格按照試劑盒說明方法染色，所有切片染色均在相同條件下進行，每批染色均設陽性對照(試劑公司提供)和陰性對照(PBS代替一抗)。光學顯微鏡觀察組織切片標本，兩位病理科專家以雙盲法認定結果。CXCR4、Cyclin D1、EGFR及Ki-67均以出現黃色或棕黃色顆粒為陽性細胞，CXCR4表達于細胞漿內；EGFR表達于細胞膜和胞漿，以包膜明顯；Ki-67和Cyclin Dl均表達于細胞核內。結果判斷：根據染色強度評分，無染色為0分，呈現淡黃色顆粒、明顯高于背景為1分，呈現淺棕黃色顆粒為2分，出現大量深棕黃色顆粒為3分；根據陽性細胞數評分，每片隨機觀察5個視野，計數500個細胞中染色陽性細胞數，陽性細胞數<5%為0分，陽性細胞數5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色強度評分與陽性細胞數比例的評分相加之和<2為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)；弱陽、中陽、強陽均判為陽性，以中度陽性和強陽性為過表達。

1.3觀察指標

比較CXCR4在對照組和EOC組的陽性表達率，分析CXCR4、Cyclin D1、EGFR及Ki-67在EOC患者癌組織中的陽性表達率與患者年齡、組織學分級、是否有淋巴轉移及TNM臨床分期的關系，采用Spearman秩相關分析EOC患者癌組織中CXCR4表達與EGFR、Cyclin D1及Ki-67表達的相關性。

1.4統計學方法

數據應用SPSS 16.0統計軟件包統計，以率(%)表示，兩樣本率的比較采用四格表資料的χ2檢驗，不滿足χ2檢驗條件時采用連續校正公式或FISH精確概率檢驗法。相關性采用Spearman秩相關分析，以相關系數(r)判斷相關性，以P<0.05為有統計學意義。

2　結果

2.1CXCR4表達

CXCR4在對照組中呈陽性表達率為20%，觀察組為57.50%，兩組陽性表達率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2EOC癌組織中CXCR4、EGFR、Cyclin D1及Ki-67表達

EOC患者癌組織中的CXCR4的陽性表達率與EOC患者臨床分期、組織學分級及有無淋巴轉移有關(P<0.05)，與年齡無關(P>0.05)；EOC患者中Cyclin D1陽性表達率與臨床分期、組織學分級有關(P<0.05)，而與年齡、有無淋巴結轉移無關(P>0.05)；EGFR與Ki-67的過表達率與臨床分期有關(P<0.05)，而與年齡、組織學分級及有無淋巴轉移無關(P>0.05)。 見圖1及表1。

注：A、B為Cyclin D1，C、D為Ki-67，E、F為CXCR4，G、H為EGFR；A、C、E、G為觀察組中的強陽性表達，B、D、F、H為對照組中陰性表達圖1　EOC患者癌組織中CXCR4、Cyclin D1、EGFR和Ki-67的表達(SP,×20)Fig.1　The expression of CXCR4, Cyclin D1, EGFR and Ki-67 in benign and malignant epithelial ovarian cancer

指標CXCR4陽性陽性(n)χ2PCyclinD1陽性陽性(n)χ2PEGFR過表達過表達(n)χ2PKi-67過表達過表達(n)χ2P年齡(歲) ≤45132.90.08142.351.30150.180.68140.100.85 >4510121615組織學分級 1+2128.20.01147.140.01200.980.32181.940.16 311121111淋巴轉移 有74.30.0460.690.4171.150.2871.760.18 無16202422TNM分期 Ⅰ+Ⅱ612.30.0097.030.01125.160.02915.120.00 Ⅲ+Ⅳ17171920

2.3EOC患者癌組織中CXCR4表達與Cyclin D1、EGFR和Ki-67表達相關性

EOC患者癌組織中CXCR4的陽性表達與Cyclin D1的陽性表達、EGFR的過表達及Ki-67的過表達之間呈現正相關性(r=0.535、0.5060.490，P<0.05)。

3　討論

EOC是婦科常見的惡性腫瘤，因其轉移、復發致患者病情不能控制，死亡率高，5年生存率僅30%。目前認為細胞增殖失控和轉移是EOC發生發展的基礎。CXCR4在多種腫瘤細胞中均有表達，當與其配體CXCL12結合后形成CXCR4-CXCL12軸，此軸在腫瘤細胞的趨化及粘附、血管生成、侵襲和轉移等方面發揮著至關重要的作用[2]。CXCR4在EOC中高表達，可促進EOC細胞增殖、侵襲和腫瘤血管生成[3]。 燕霞等[4]研究發現，CXCR4與淋巴結轉移密切相關，認為CXCR4在促進淋巴轉移過程中起著重要作用。本研究發現CXCR4在EOC中的表達顯著高于卵巢良性腫瘤，差異有統計學意義(P<0.05)；在EOC中，CXCR4表達與臨床分期、組織分級及淋巴轉移有關，分期越晚，組織分級越高及有淋巴轉移者CXCR4陽性表達越高。與劉靜等[5]研究相符，提示：CXCR4在EOC形成、增殖、浸潤及轉移中有著重要作用。 Cyclin D1是細胞周期調節因子，可促進G1期向S期轉化，加速細胞增殖，誘發腫瘤。其過表達可使EOC細胞增殖形成腫瘤。EGFR屬于酪氨酸蛋白激酶，可以促進腫瘤細胞的增殖、粘附、侵襲、轉移和腫瘤血管生成，還能抑制腫瘤細胞的凋亡[6]。大量研究顯示：EGFR異常可導致卵巢出現惡變。Ki-67被認為是一種增殖細胞核抗原，在多種惡性腫瘤中均有表達及過表達。宋振飛等[7]研究發現：Cyclin D1及EGFR在EOC中的表達與臨床分期及細胞分化程度有關 ，認為兩者在EOC中過表達，并在一定程度上反映其惡性程度及預后狀況。發現：EGFR和Ki-67表達在EOC的組織學分級、臨床分期和有無淋巴結轉移中具有統計學差異，認為兩者在EOC的發生、發展中起著重要的作用 。本研究顯示：Cyclin D1陽性表達率在臨床分期、組織學分級方面差異具有統計學意義，而在年齡、淋巴結轉移方面比較差異無統計學意義；EGFR與Ki-67的過表達率和臨床分期有關，而與年齡、組織學分級及有無淋巴轉移無關,與楊越等[8]研究結果部分相符，提示Cyclin D1、EGFR和Ki-67在EOC的形成和發展中起著重要作用，但本研究認為EGFR與Ki-67的過表達率僅與臨床分期有關，與上述研究有差異，可能與樣本量小以及判斷標準不一致有關。有研究報道，CXCR4和EGFR有關聯,兩者相互作用可引起細胞內的ERK1/2和Akt通路啟動從而引起EOC細胞的增殖[9]。而關于CXCR4與CyclinD1及Ki-67在EOC中表達的相關性未見報道。本研究結果顯示，在EOC患者癌組織中CXCR4表達和CyclinD1、EGFR及Ki-67表達呈正相關性，可能機制為CyclinD1、EGFR及Ki-67上調CXCR4表達共同促進了EOC的增殖、浸潤及淋巴轉移。

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(2016-06-25收稿，2016-08-31修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 劉華

Expression and Significance of CXCR4 in Epithelial Ovarian Cancer

CHEN Guoqing1,2, WANG Xingxin2, ZI Dan1

(1.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,thePeople'sHospitalofWeiningCounty,Weining553100,Guizhou,China)

Objective: To investigate the expression of CXCR4, Cyclin D1, EGFR and Ki-67 in epithelial ovarian cancer (EOC) and its relationship with clinical pathological features. Methods: 40 cases of patients with epithelial ovarian cancer (observation group) and 10 cases of patients with ovarian benign tumor (control group) were tested for the expression of CXCR4, Cyclin D1, EGFR and Ki-67 protein by SP immunohistochemical assay kit. Combined with the medical record data, the relationship between the 4 cytokines and the clinical pathological characteristics was analyzed. Meanwhile, the relationship between CXCR4 and the other 3 cytokines was also analyzed. Results: The positive expression rate of CXCR4 in the observation group were significantly higher than those in the control group (P<0.05). There were statistically significant differences in the positive expression rate of CXCR4 under different pathology parameters such as clinical stage, histological grade and lymph node metastasis (P<0.05). There were statistically significant differences in the positive expression rate of Cyclin D1 under different pathology parameters such as clinical stage, histological grade and lymph node metastasis(P<0.05). The over expression rates of Ki-67 and EGFR was significantly related to clinical stage (P<0.05). CXCR4 were positively correlated with the expression of Cyclin D1, EGFR and Ki-67 in epithelial ovarian cancer(P<0.05). Conclusion: The joint detection of CXCR4, Cyclin D1, EGFR and Ki-67 may have important reference significance in prognosis of EOC and the choice of treatment of EOC.

ovarian tumor epithelial; chemokine receptor type 4; cell cycle protein D1; epidermal growth factor receptor; immunohistochemistry; staining method

貴州省科技廳聯合基金[黔科合LG 字(2011) 032 號]

E-mail:2816497455@qq.com

R737.31

A

1000-2707(2016)09-1071-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.019

**貴州醫科大學2015級同等學歷碩士研究生，現工作于威寧縣人民醫院

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網絡出版時間：2016-09-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.014.html