pH敏感磁靶向納米給藥系統的構建及其對HepG2腫瘤細胞的作用*

馬紅巖， 喬桂紅

(商丘醫學高等專科學校 臨床醫學系， 河南 商丘　476005)

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pH敏感磁靶向納米給藥系統的構建及其對HepG2腫瘤細胞的作用*

馬紅巖， 喬桂紅

(商丘醫學高等專科學校 臨床醫學系， 河南 商丘476005)

目的： 構建一種新型的磁性靶向pH敏感控釋納米給藥系統并考察其對HepG2腫瘤細胞的抑制作用。方法： 將四氧化三鐵(Fe3O4)衍生至碳納米管(CNTs)表面，使用聚乙烯亞胺/聚乙二醇對載體進行修飾，利用聚乙烯亞胺具有的豐富的氨基末端與阿霉素(DOX)結合，通過具有pH敏感的腙鍵相連構建CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX給藥系統；分別使用透射電鏡(TEM)、X射線衍射儀(XRD)、傅里葉紅外光譜儀(FT-IR)、磁強計(VSM)對給藥系統進行相關表征分析，考察給藥系統熱療升溫、載藥及pH敏感釋放情況；將培養的HepG2腫瘤細胞分為空白對照組、CNTs-Fe3O4-PEI/PEG組、PTT熱療組、DOX組、DOX聯合PTT熱療組、CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX組、CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX聯合PTT熱療組、CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX磁性靶向聯合PTT熱療處理組，使用MTT法檢測以上8組中HepG2細胞的抑制率。結果： 成功構建CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX納米給藥系統，DOX的載藥率為65.04%，pH值降低時，DOX的累計釋放率明顯迅速升高；該給藥系統的磁化強度為19.92 emu/g，具有明顯的磁性靶向性；CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX在近紅外光照射下可在5 min內迅速升溫至(58.7±2.5)℃，具有明顯的熱療升溫作用；給藥系統聯合熱療對腫瘤細胞具有明顯的抑制作用。結論： CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX是一種新型的具有磁性靶向、pH敏感控釋以及熱療作用的多功能智能化的給藥系統，對HepG2腫瘤細胞有較強的抑制率。

磁靶向； 碳納米管； pH敏感； 阿霉素； 熱療

阿霉素(doxorubicin，DOX)是一種臨床上常用的廣譜抗癌藥物，但其治療過程中伴隨的心臟毒性限制了它的應用[1]。通過納米載體構建一種可以有效輸送DOX到達病變部位，且能在靶向部位控釋的給藥系統是該類研究的新思路[2]。研究表明，腫瘤部位較正常組織pH值低，利用腫瘤組織與正常組織pH值的差別，構建一種具有pH敏感的控釋系統是降低化療藥物毒性的有效途徑[3]。近年來，多功能智能化腫瘤靶向納米給藥系統逐漸成為科學家研究的新方向[4-5]。碳納米管(carbon nanotubes，CNTs)是一種納米材料，具有多種獨特的物理化學性能，可作為多種藥物及生物大分子的載體，但單純的載藥并不能滿足治療的需求，給藥系統的靶向性是藥物能夠有效到達靶向部位的關鍵[6-7]。含有四氧化三鐵(Fe3O4)的抗腫瘤給藥系統可以通過磁靶向作用將藥物準確靶向到腫瘤部位，提高藥物的治療效果，減輕毒副作用[8]。本研究將Fe3O4對CNTs進行衍生化，使用聚乙烯亞胺(PEI)和聚乙二醇(PEG)對載體進行功能化，從而改善CNTs的生物相容性，降低其毒性，提高其體內長循環特性。

1　材料與方法

1.1儀器與材料

鹽酸DOX(上海晶純生化科技股份有限公司)，RPMI1640培養基、胎牛血清(美國Hyclone公司)，羧基化聚乙二醇2000(distearoyl phosphoethanolamine-PEG2000，COOH-PEG2000，國藥集團化學試劑有限公司)，羧基苯肼(4-hydrazinobenzoic acid，HBA)、聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI，MW=25 000)、1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽[N-Ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochlorid，EDC]、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS，)、二環己基碳二亞胺(dicyclohexylcarbodiimide，DCC，)及其他試劑均購自美國Sigma公司，人乳腺癌MCF-7細胞系(上海復祥生物科技有限公司)。透射電鏡(TEM，Tecnai G2 20型，荷蘭FEI公司)、X射線衍射儀(XRD，7000S/L型，日本島津公司)、傅里葉紅外光譜儀(FT-IR，FTIR-7600型，澳大利亞Lambda公司)、磁強計(VSM，型號BHV-55，日本理研電子公司)。

1.2羧基化CNTs(CNTs-COOH)的制備

稱取多壁CNTs-COOH 120 mg，置于250 mL圓底燒瓶中，加入混酸溶液(V濃硫酸∶V濃硝酸=3∶1)120 mL，并加入30%過氧化氫12 mL，超聲波清洗4 h后，用超純水稀釋，使用0.45 μm微孔濾膜和布氏漏斗抽濾，超純水沖洗至pH為中性為止，放入烘箱中80 ℃恒溫干燥，即得CNTs-COOH。

1.3磁性碳納米管(CNTs-Fe3O4-COOH)的制備

稱CNTs-COOH 20 mg置于100 mL圓底燒瓶中，加入乙二醇-二甘醇混合溶液(V乙二醇∶V二甘醇=1∶19)20 mL，并使CNT均勻的分散在混合溶液中，然后依次緩慢加入醋酸鈉0.3 g和FeCl3·6H2O 0.108 g。將上述液體轉入聚四氟乙烯內襯高壓反應釜并置于200 ℃干燥箱中，保溫10 h后自然冷卻至室溫。將反應釜內產物用無水乙醇和超純水反復洗滌，真空干燥12 h，即得CNTs-Fe3O4-COOH。

1.4CNTs-Fe3O4-COOH的功能化

將 CNTs-Fe3O4-COOH 200 mg溶于二氯甲烷中50 mL，加入過量PEI及DCC，超聲30 min后，冷凝回流反應48 h。使用磁鐵收集反應成功的CNTs-Fe3O4-PEI，超純水洗滌3次，冷凍干燥。將 CNTs-Fe3O4-PEI 50 mg溶于PBS緩沖液50 mL中(pH 7.4)，加入 PEG-COOH 1 mg、EDC 50 mg及NHS 25 mg，室溫攪拌反應24 h，使用磁鐵吸附CNTs-Fe3O4-PEI/PEG，超純水洗滌3次，冷凍干燥備用。

1.5CNTs-Fe3O4-COOH負載DOX

將CNTs-Fe3O4-PEI/PEG 50 mg和HBA 50 mg加入PBS緩沖液50 mL 中(pH 7.4)，然后加入EDC 50 mg及NHS 25 mg，室溫下攪拌反應48 h。使用磁鐵收集CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-HBA，乙醇洗滌3次，冷凍干燥備用。稱取CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-HBA 50 mg與DOX 80 mg一同加入到DMSO中，室溫攪拌避光反應24 h。使用磁鐵吸附CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX，除去未反應完成的雜質，超純水洗滌吸附物3次，凍干備用。CNTs-Fe3O4-PEI/PEG的FT-IR圖中出現的明顯的C-H(2 885 cm-1,3 450 cm-1)振動峰，表明其合成成功[9]。CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-HBA出現了新的酰胺特征峰(1 654 cm-1,1 375 cm-1)，-NH2彎曲振動峰(1 600 cm-1)，表明HBA已被連接至CNTs表面。1 654 cm-1和1 375 cm-1處的特征峰表明DOX已通過腙鍵連接至CNTs-Fe3O4-PEI/PEG[10]。

1.6給藥系統的表征

分別使用TEM、XRD、FT-IR、VSM對制備好的給藥系統進行表征，并考察給藥系統在808 nm近紅外光下產熱情況。

1.7給藥系統載藥量及pH敏感釋放性質考察

使用Lambda 35型可見光-紫外掃描儀(美國Perkin-Elmer公司)，在490 nm波長處對DOX的載藥情況進行考察。同時，通過透析法考察給藥系統在不同pH值(pH 5.5和pH 7.4)時釋放DOX的情況。

1.8給藥系統細胞抑制率考察

HepG2細胞培養于10%胎牛血清及1%青鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養液中常規培養，細胞分為空白對照組、CNTs-Fe3O4-PEI/PEG組、PTT熱療組、DOX組、DOX聯合PTT熱療組、CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX組、CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX聯合PTT熱療組、CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX磁性靶向聯合PTT熱療處理組。取對數生長期的HepG2細胞，以0.6×104個每孔接種到96孔板中。培養24 h后，空白對照組加入新鮮培養液，其他組分別加入對應制劑，每組設6個復孔。其中，每組中含有的DOX終濃度為5.2 mg/L(IC50濃度)，CNTs-Fe3O4-PEI/PEG為8 mg/L。磁性靶向處理使用永磁鐵放置于培養板下相應孔部位。近紅外熱療組處理方法為加入制劑6 h后，使用808 nm波長的近紅外激光照射，每孔照射2 min。繼續培養48 h后棄去培養液，每孔加入新鮮配制的MTT溶液(0.5 g/L)，37 ℃孵育4 h，加入二甲基亞砜并振蕩，通過酶標儀測定490 nm波長處的吸光度(OD)值，計算各組HepG2細胞抑制率。以上過程重復3次。細胞抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.9統計學方法

2　結果

2.1CNTs載體的TEM及XRD分析

單純CNTs的TEM結果顯示，CNTs表面光滑，呈管狀(圖1A)。CNTs-Fe3O4-COOH的TEM與單純CNTs相比，管壁表面出現了明顯的納米粒(圖1B)。使用XRD法對CNTs-Fe3O4-COOH進行物質結構分析，結果顯示在26.32°的2θ角處出現CNTs 002(JCPDS:41-1487)晶面的特征衍射峰，并且出現了220、311、400、422、511、440峰，均為Fe3O4的晶面特征衍射峰(JCPDS:19-0629)(圖1C)。

2.2給藥系統的FT-IR光譜分析

FT-IR光譜結果表明CNTs(圖2A)可被PEI及PEG共同功能化，且DOX可通過腙鍵被連接至CNTs表面。位于1 715 cm-1的-COOH特征峰表明CNTs已被成功羧基化(圖2B)，568 cm-1的Fe-O特征峰表明Fe3O4已衍生至CNTs表面(圖2C)。圖2D中出現的C-N(1 108 cm-1)、N-H(1 635 cm-1,1 560 cm-1,3 450 cm-1)和C-H(2 924 cm-1)特征峰表明PEI修飾成功。以上結果表明CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX已成功合成。

注： A為CNTs的TEM，B為CNTs-Fe3O4-COOH的TEM，C為CNTs-Fe3O4-COOH的XRD圖譜圖1　CNTs、CNTs-Fe3O4-COOH的TEM以及XRD圖譜Fig.1　TEM and XRD spectrum of CNTs and CNTs-Fe3O4-COOH

2.3給藥系統的磁性分析

圖3A和B中的水溶液明顯不同，CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX腫瘤靶向納米藥物遞送系統在永磁鐵的作用下迅速收攏至永磁鐵范圍內。磁滯曲線分析結果表明，CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX的磁化強度為19.92 emu/g(圖3C)。以上結果均證明該系統具有明顯的磁性靶向作用。

2.4給藥系統的載藥率及體外pH敏感釋放分析

最終測定的DOX載藥率為65.04%(WDOX：WCNTs-Fe3O4-PEI/PEG)。圖4顯示，在pH為5.5時，DOX的釋放明顯加快，終累計釋放率高于80%，表明在120 h的考察期間DOX并沒有完全釋放，這和DOX與CNTs表面結構的π-π堆積作用有一定的關系。在pH為7.4的環境中，DOX最終的累計釋放率為18%。以上結果表明，CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX具有明顯的pH敏感控釋特性。

2.5給藥系統的近紅外升溫考察

CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX在近紅外光照射下的升溫考察結果表明，該給藥系統具有明顯的近

注：A為CNTs，B為CNTs-COOH，C為CNTs-Fe3O4-COOH，D為CNTs-Fe3O4-PEI，E為CNTs-Fe3O4-PEI/PEG，F為CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-HBA，G為CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX圖2　給藥系統的FT-IR光譜分析Fig.2　FT-IR spectrum analysis of drug delivery system

紅外熱療增敏效果。CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX水溶液可在5 min內升溫至58.7度，在后期研究中可將其聯合近紅外熱療，達到更好的抗腫瘤效果。見圖5。

注： A為未放置永磁鐵的CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX水溶液，B為將永磁鐵放置于CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX水溶液側方，C為CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX的磁滯曲線圖3　給藥系統的磁性分析Fig.3　Magnetic analysis of drug delivery system

圖4　不同pH值環境下CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX的累計釋放率Fig.4　DOX cumulative release profiles of DOX in different pH environments

圖5　近紅外光照射下CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX溶液溫度變化曲線Fig.5　Temperature changes of CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX (black) and water (gray) solution with NIR irradiation treatment at different times

2.6HepG2細胞抑制率

MTT實驗結果顯示，CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX磁性靶向聯合PTT熱療組的細胞抑制率與DOX組、CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX和DOX聯合PTT熱療組相比，差異有統計學意義(P=0.001、0.012、0.003)，CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX磁性靶向聯合PTT熱療組的腫瘤細胞抑制率明顯高于CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX 聯合PTT熱療組，差異有統計學意義(P=0.011)。

注：A為空白對照組，B為 CNTs-Fe3O4-PEI/PEG組，C為PTT熱療組，D為 DOX組，E為DOX聯合PTT熱療組，F為 CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX組，G為CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX 聯合PTT熱療組，H為 CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX磁性靶向聯合PTT熱療圖6　HepG2細胞的抑制率Fig.6　Cellular inhibition rate of HepG2 cells

3　討論

目前，腫瘤的主要治療手段除了手術治療外，還有最常見的化學療法。作為常用的抗癌化療藥物，DOX的使用常伴有嚴重的器官毒性，限制了它的應用，其對病人造成了極大的痛苦，所以限制了它的應用[11]。因此，改善DOX的生物毒性及耐藥性成為相關領域的研究熱點。

腫瘤靶向和定點控釋是改善DOX毒性的有效途徑。研究表明，腫瘤部位的pH值明顯低于正常組，可利用靶向基團將給藥系統遞送至腫瘤部位，然后通過pH敏感型化學鍵對DOX控釋[3，12]。Shi等[10]通過pH敏感鍵構建了富勒烯腫瘤靶向給藥系統，證明該系統在腫瘤環境下可迅速釋放。Wang等[13]構建pH敏感型的CNTs荷載DOX給藥系統，但是該課題使用物理吸附的方式荷載DOX，僅利用DOX本身的pH敏感性進行緩控釋，在體內較復雜的生物環境中較難完全控制DOX的釋放。本研究將具有磁靶向性的Fe3O4納米粒衍生至CNTs表面，并將具有pH敏感的腙鍵將DOX與載體連接，使給藥系統具有磁性靶向性及pH敏感控釋特性。結果表明，本課題組制備的CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX腫瘤磁性靶向藥物傳遞系統在低pH值的環境中，腙鍵可有效斷裂導致DOX的大量釋放，同時該給藥系統具有磁性尋靶功能。這種靶向釋放模式，有望降低DOX對正常組織的毒性，同時在磁性靶向引導下的定點部位快速大量釋放也可降低腫瘤對于藥物的耐藥性。

CNTs的功能化是其有效應用于生物治療的關鍵，適當的功能化可降低生物毒性、提高生物相容性，并且新的化學基團的引入可使其具有更多衍生化的可能[14]。本研究使用PEI和PEG對CNTs載體進行修飾，并通過FT-IR光譜證明PEI/PEG修飾成功。其中PEI的樹枝狀結構和其具有的豐富氨基基團可連接更多的藥物，并對藥物其到一定的保護作用。而PEG具有體內長循環作用，除了可以提高給藥系統的生物相容性，還可以使藥物更長時間的滯留于體內發揮藥效[15]。

作為一種新興的腫瘤治療輔助手段，熱療逐漸進入臨床的研究及應用。將傳統化療與熱療聯合，將達到更加強力的抗腫瘤作用[16]。惡性腫瘤的血液循環差，導致其散熱性能變差，腫瘤對熱療十分敏感。42 ℃～45 ℃時即可殺傷腫瘤細胞，而正常組織器官血液循環良好，熱量能夠被及時擴散，從而不易被熱療損害。研究證實，CNTs具有明顯的近紅外光熱治療效應，可用于腫瘤化療及熱療聯合應用[17]。本構建的CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX給藥系統可在近紅外光的照射下明顯升溫，并對腫瘤細胞產生明顯殺傷作用。將CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX具有的磁靶向性與熱療、化療聯合抑制HepG2細胞增殖實驗表明，該組抑制率可達(77.2±2.5)%。

綜上所述，CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX給藥系統具有腫瘤磁性靶向、體內長循環、pH敏感控釋以及熱療作用，是一種潛在的多功能智能化的給藥體系，在后期的研究中該給藥系統可將多種治療機制聯合用于腫瘤細胞的深入治療研究及體內研究。

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(2016-05-25收稿，2016-08-28修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華

Construction of A pH-sensitive Magnetic Targeting Nano-drug Delivery System and Its Effect on HepG2 Tumor Cells

MA Hongyan, QIAO Guihong

(DepartmentofClinicalMedicine,ShangqiuMedicalCollege,Shangqiu476005,Henan,China)

Objective: To construct a new type of magnetic-targeting and pH-sensitive controlled release drug delivery system and investigate its inhibitory effect on HepG2 tumor cells. Method: Fe3O4nanoparticles were loaded onto the surface of carbon nanotubes (CNTs). Then, polyethyleneimine (PEI) and poly (ethylene glycol) (PEG) were used to functionalized the carrier. Finally, doxorubicin (DOX) was conjugated to the amino groups of PEI through pH-sensitive hydrazone bonds to construct the CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX drug delivery system. Transmission electron microscope (TEM), X-ray diffractometer (XRD), fourier transform infrared spectrometer (FT-IR) and magnetometer were adopted to analyze the characteristics of this drug delivery system. The hyperthermia effect, drug loading rate and pH-sensitive controlled release in vitro were investigated. The HepG2 tumor cells were divided into control group, CNTs-Fe3O4-PEI/PEG group, PTT hyperthermia group, DOX group, DOX PTT combined with hyperthermia group, CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX group, CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX combined with PTT hyperthermia group, and CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX magnetic targeting combined with PTT hyperthermia group, and MTT method was used to detect the inhibitory rates of HepG2. Results: The CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX drug delivery system was constructed successfully, and DOX loading rate was 65.04% (WDOX：WCNTs-Fe3O4-PEI/PEG). When the pH value was decreased, the cumulative release rate of DOX was increased significantly, which proved that the drug delivery system had pH sensitive controlled release properties. The magnetic investigation results showed that the magnetization of the drug delivery system was 19.92 emu/g, showing obvious magnetic targeting. The drug delivery system can rapidly heated up to (58.7±2.5)℃ in 5 minutes with the near infrared light treated, showing obvious hyperthermia warming effect. The combination of chemotherapy and photothermal therapy had significant inhibitory effects on growth of HepG2 tumor cells. Conclution: CNTs-Fe3O4-PEI/PEG-DOX is a new type of multifunctional intelligent drug delivery system with magnetic-targeting, pH-sensitive controlled release and hyperthermia effects, which has significant inhibitory effects on growth of HepG2 tumor cells.

magnetic targeting; carbon nanotubes; pH-sensitive; doxorubicin; photothermal therapy

商丘市科技發展計劃項目(153051)

R943

A

1000-2707(2016)09-1047-06

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.013

網絡出版時間：2016-09-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.054.html