扁蒴藤素對紫杉醇耐藥乳腺癌細胞生長的抑制作用*

謝閨娥， 杜晶春， 董桂蘭， 徐　霞**

(1.廣州醫科大學 金域檢驗學院， 廣東 廣州　510182； 2.廣州大學 門診部， 廣東 廣州　510006)

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扁蒴藤素對紫杉醇耐藥乳腺癌細胞生長的抑制作用*

網絡出版時間：2016-09-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.012.html

謝閨娥1， 杜晶春1， 董桂蘭2， 徐霞1**

(1.廣州醫科大學 金域檢驗學院， 廣東 廣州510182； 2.廣州大學 門診部， 廣東 廣州510006)

目的： 研究扁蒴藤素對紫杉醇耐藥乳腺癌細胞MCF-7/TAX生長的作用。方法： 以乳腺癌細胞株MCF-7為對照，同時制作紫杉醇耐藥乳腺癌細胞MCF-7/TAX；在兩組細胞中分別給與7種濃度(0.25、0.5、1、2.5、5、10和20 μmol/L)扁蒴藤素或紫杉醇培養48 h，用MTT法檢測藥物對MCF-7和MCF-7/TAX細胞作用的半數抑制濃度(IC50)值，并計算MCF-7/TAX細胞對紫杉醇或扁蒴藤素的耐藥指數(RI)；同時用Annexin V-FITC/PI染色觀察扁蒴藤素作用后MCF-7/TAX凋亡細胞比例。結果： MCF-7/TAX對紫杉醇RI達19.39，而扁蒴藤素對MCF-7/TAX細胞的生長有高效抑制作用，且呈現明顯的劑量依賴性，對其作用48 h的IC50為0.52 μmol/L，MCF-7/TAX對扁蒴藤素的RI僅為0.88；扁蒴藤素作用后，Annexin V染色陽性的MCF-7/TAX細胞比例較對照明顯升高。結論： 扁蒴藤素能抵抗紫杉醇耐藥乳腺癌細胞的耐藥性，激活MCF-7/TAX細胞凋亡，對其生長發揮高效抑制作用。

紫杉醇耐藥； 扁蒴藤素； MCF-7/TAX； 凋亡

南蛇藤衛矛科南蛇藤屬植物，在我國廣泛分布。現已從南蛇藤中提取出大量萜類、生物堿、黃酮類化合物，三萜類化合物主要存在于南蛇藤的根皮中，研究表明，其中的扁蒴藤素(Pristimerin)具有廣譜抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種藥理活性[1-7]。紫杉醇廣泛應用于包括乳腺癌在內的多種惡性腫瘤的治療，然而腫瘤對紫杉醇的耐藥性嚴重影響了治療效果[8-9]。本文以紫杉醇耐藥乳腺癌細胞株MCF-7/TAX為模型，研究扁蒴藤素對紫杉醇耐藥乳腺癌細胞株MCF-7/TAX生長的作用，為探索抵抗紫杉醇耐藥性的腫瘤高效化療藥物提供實驗依據。

1　材料和方法

1.1主要材料與試劑

人乳腺癌MCF-7細胞系購自美國模式培養物保藏所(american type culture collection, ATCC)，MCF-7紫杉醇耐藥細胞株(MCF-7/taxol-resistant, MCF-7/TAX)購自廣州吉尼歐生物科技有限公司，扁蒴藤素、紫杉醇、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、碘化丙啶 (propidium iodide, PI)購自美國Sigma公司，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)為美國Hyclone公司產品，DMEM培養基、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素混合溶液及Hepes為美國Gibco公司產品，MTT購自美國Genview公司，細胞培養板為美國Corning公司產品，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Roche公司，其他試劑均為進口或國產分析純試劑。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養MCF-7細胞培養于含10% FBS、100 000 IU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM完全培養基中，紫杉醇耐藥乳腺癌細胞MCF-7/TAX培養于含1.0 μmol/L紫杉醇的上述培養基中以維持其耐藥表型；傳代時用含0.02%EDTA的0.05%胰酶消化，以DMEM完全培養基終止消化。

1.2.2MTT比色法取傳代培養24 h后增長迅速、處于對數生長期的細胞，用胰酶消化，制成單細胞懸液，調整細胞濃度為5×107/L；每孔種200 μL細胞懸液于96孔培養板內，將培養板置37 ℃、5% CO2飽和濕度孵箱內培養；24 h后，取出培養板，吸去舊培養液，加入不同濃度的扁蒴藤素(設7個濃度：0.25、0.5、1、2.5、5、10和20 μmol/L)或不同濃度的紫杉醇(設7個濃度：0.25、0.5、1、2.5、5、10和20 μmol/L)，同時設立對照組，每組均設3個平行孔，置37 ℃、5% CO2飽和濕度孵箱內培養；48 h后取出96孔板，在超凈工作臺內每孔加MTT(5 g/L)20 μL，培養箱內繼續培養4 h；取出培養板，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞內MTT與線粒體酶反應后生成的藍紫色結晶物；用注射器小心吸棄培養基，加入100 μL DMSO置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解；用酶聯免疫檢測儀在570 nm波長處測定其吸光度(OD)值，計算生長抑制率：抑制率%=[(1-OD加藥組)/OD對照組]×100%，并參照文獻[9]用Bliss’s軟件計算半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)值。耐藥指數(resistance index，RI)=耐藥細胞IC50/親本細胞IC50。

1.2.3Annexin V-FITC/PI染色取對數生長期的人乳腺癌細胞MCF-7/TAX接種于培養皿內，置37 ℃、5% CO2孵箱中培養過夜；加入終濃度為1.0 μmol/L的扁蒴藤素，8 h后用不含EDTA的胰蛋白酶將細胞從培養皿消化下來，制成單細胞懸液，PBS洗滌細胞2次；用1×binding buffer懸浮細胞至1×109個/L，取100 μL細胞懸液加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI，混勻，室溫避光反應15 min；然后再加入400 μL 1×binding buffer充分混合后在流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況。

1.3統計學方法

2　結果

2.1MCF-7/TAX對紫杉醇的耐藥情況

MTT結果顯示(圖1A)，紫杉醇對MCF-7作用48 h的 IC50為1.07 μmol/L，對紫杉醇耐藥細胞株MCF-7/TAX作用48 h的 IC50為20.75 μmol/L，RI達19.39(表1)。

2.2扁蒴藤素對MCF-7/TAX的生長抑制情況

MTT結果顯示(圖1B)，扁蒴藤素能抑制紫杉醇耐藥細胞MCF-7/TAX的生長，且具有明顯的劑量依賴性，作用48 h的 IC50僅為0.52 μmol/L，對MCF-7作用48 h的 IC50為0.59 μmol/L，MCF-7/TAX對扁蒴藤素的RI僅為0.88(表1)。

表1　扁蒴藤素及紫杉醇對MCF-7/TAX和MCF-7細胞的IC50及RI

2.3扁蒴藤素誘導MCF-7/TAX細胞凋亡

Annexin V-FITC/PI雙染法結果顯示，MCF-7/TAX不加扁蒴藤素的細胞凋亡率為0.8%，加1.0 μmol/L扁蒴藤素作用8 h后的細胞凋亡率達28.9%，凋亡細胞的比例明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

3　討論

腫瘤細胞對多種化學藥物產生交叉耐藥性，稱多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)，是造成腫瘤化療失敗的主要原因[10]。由于傳統的抗癌藥在化療過程中都往往會導致多藥耐藥的產生，因此開發一些新的能夠對多藥耐藥的腫瘤細胞也敏感的抗癌藥物是當務之急。扁蒴藤素是雷公藤紅素的甲酯衍生物，主要存在于衛矛科和希藤科植物中。隨著研究范圍不斷擴大，扁蒴藤素的多種藥理活性逐漸被人們關注和研究，研究表明扁蒴藤素具有抗炎、抗氧化等多種藥理活性，并具有廣譜抗腫瘤作用[1-7]。據報道，給藥6 h后，3 μmol/L的扁蒴藤素可抑制81%人乳腺癌細胞MDA-MB-231的生長[11]。但有關于扁蒴藤素研究的報道還很有限，其對紫杉醇耐藥乳腺癌細胞的作用尚未明確。

注：A為紫杉醇，B為扁蒴藤素；(1)與MCF-7/TAX+紫杉醇比較，P<0.05圖1　MCF-7/TAX細胞對紫杉醇和扁蒴藤素耐藥情況(MTT法)Fig.1　The resistance situation of MCF-7/TAX cells to paclitaxel by MTT assay

注：A為對照，B為1.0 μmol/L扁蒴藤素；橫坐標為Annexin-V，縱坐標為PI圖2　扁蒴藤素對MCF-7/TAX細胞凋亡的影響(Annexin V-FITC/PI)Fig.2　Effect of pristimerin on apoptosis of MCF-7/TAX cells (Annexin V-FITC/PI staining)

本文對扁蒴藤素對紫杉醇耐藥細胞株MCF-7/TAX生長的影響進行了探討。MTT比色結果顯示，紫杉醇耐藥細胞株MCF-7/TAX對紫杉醇的耐藥指數達19.39；而扁蒴藤素作用MCF-7/TAX細胞48 hr的IC50僅為0.52 μmol/L，降低其耐藥指數至0.88，說明扁蒴藤素能抵抗紫杉醇耐藥乳腺癌細胞的耐藥性，對其生長發揮高效抑制作用。凋亡是一種生理性、程序性的細胞死亡過程，細胞凋亡異常是腫瘤發生與發展的關鍵因素之一。MDR產生的機制非常復雜，研究表明凋亡逃逸(細胞抗凋亡能力提高)也是其重要機制之一。激發和恢復腫瘤細胞發生凋亡的能力，是腫瘤防治的有效途徑[12]。本研究Annexin V-FITC/PI染色結果表明，經扁蒴藤素作用后，Annexin V-FITC染色陽性的MCF-7/TAX細胞比例升高，表明扁蒴藤素能誘導紫杉醇耐藥MCF-7/TAX細胞凋亡的發生。

本研究結果證實，扁蒴藤素能抵抗紫杉醇耐藥乳腺癌細胞的耐藥性，激活MCF-7/TAX細胞凋亡，從而對其生長發揮高效抑制作用，這將為開發治療紫杉醇耐藥的新藥提供實驗依據。

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(2016-03-25收稿，2016-07-31修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 劉華

Inhibitory Effect of Pristimerin on Growth of Taxol-Resistant Breast Cancer Cells

XIE Guie1, DU Jingchun1, DONG Guilan2, XU Xia1

(1.KingmedSchoolofLaboratoryMedicine,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,Guangdong,China; 2.OutpatientDepartment,GuangzhouUniversity,Guangzhou510006,Guangdong,China)

Objective: To investigate the effect of pristimerin on the growth of taxol-resistant breast cancer cells MCF-7/TAX. Methods: The breast cancer cell line MCF-7 was the control group, and the taxol-resistant breast cancer cells line MCF-7/TAX was the observation group. In two groups of cells were cultured in 7 kinds of concentrations (0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 10 and 20 mol/L) pristimerin and paclitaxel for 48 h. MTT assay was used to detect half inhibition concentration (IC50) value of drug on MCF-7 and MCF-7/tax cells, and resistance index (RI) of cells to paclitaxel or pristimerin were calculated. At the same time Annexin V-FITC/PI staining was adopted to observe changes of proportion of apoptotic cells after pristimerin involvement. Results: The resistance index of MCF-7/TAX cells to paclitaxel was 19.39. After treatment with pristimerin for 48 h, MCF-7/TAX cells displayed markedly growth inhibition in a dose-dependent manner, and IC50 for 48 h was 0.52 μM. The resistance index of MCF-7/TAX cells to pristimerin was 0.88. After treatment with pristimerin, the proportion of positive MCF-7/TAX cells of Annexin V-FITC/PI staining was significantly higher than that of the control group. Conclusion: Pristimerin can resist resistance to paclitaxel resistance to breast cancer cells, activate apoptosis of MCF-7/TAX cells, thus effectively inhibit cancer cells growth.

taxol resistance; pristimerin; MCF-7/TAX; apoptosis

國家自然科學基金(81101682)； 廣東省公益研究與能力建設專項資金(2014A020212015)

R285

A

1000-2707(2016)09-1029-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.009

**通信作者 E-mail:xux2014@126.com