microRNA-29c對人胰腺癌細胞侵襲轉移的抑制作用及機制*

周顯飛， 田　舍， 王　杰， 賈亮亮， 喻　超， 江建新

(貴州醫科大學附院 肝膽外科， 貴州 貴陽　550004)

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·專題研究1·

microRNA-29c對人胰腺癌細胞侵襲轉移的抑制作用及機制*

周顯飛， 田舍， 王杰， 賈亮亮， 喻超， 江建新**

(貴州醫科大學附院 肝膽外科， 貴州 貴陽550004)

目的： 探討microRNA-29c對人胰腺癌細胞(AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2)生物學特性的影響。方法： 培養1種人正常胰腺上皮細胞(HPDE)及4種人胰腺癌細胞(AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2)，采用real-time PCR 法觀察5種細胞系中microRNA-29c 的表達差異，以microRNA-29c過表達腺病毒感染的PANC-1 和MIA PaCa2細胞作為實驗組，以空載體感染的PANC-1 和MIA PaCa2細胞作為陰性對照組，采用細胞劃痕實驗、Transwell法檢測兩組細胞體外侵襲能力，Western blot檢測兩組細胞上皮間充質轉化(EMT)相關蛋白波形蛋白(Vimentin)及E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達。結果： real-time -PCR 顯示各胰腺癌細胞系中microRNA-29c 水平明顯低于正常胰腺細胞系(P<0.05)，細胞劃痕實驗發現感染腺病毒48 h后實驗組PANC-1、MIA PaCa-2細胞的遷移距離明顯短于陰性對照組(P<0.05)，Transwell 小室細胞侵襲實驗發現實驗組PANC-1 和MIA PaCa-2 細胞侵襲數量明顯低于陰性對照組(P<0.05)；Western blot蛋白免疫印跡結果顯示PANC-1 和MIA PaCa-2細胞過表達microRNA-29c后， Vimentin表達減少，E-cadherin表達增加。結論： microRNA-29c的過表達可有效抑制胰腺癌細胞的體外侵襲與轉移，可能與Vimentin表達減少，E-cadherin表達增加有關，有望成為胰腺癌生物治療的潛在靶點。

微小RNA； microRNA-29c； 胰腺癌； 腺病毒； 細胞侵襲； 轉移； 細胞劃痕實驗

胰腺癌是惡性程度最高、預后最差的實體瘤之一，具有極為惡性的生物學特征，絕大部分患者(>85%)在確診時已伴有局部和遠處轉移，從而導致患者的5年生存率極低(<5%)[1]。因此，更多地了解胰腺癌的發病機制對于胰腺癌的早期發現、診斷及治療至關重要。microRNA是一類真核生物內源性小分子單鏈RNA, 長度通常為21～ 22個核苷酸, 能夠通過與靶mRNA特異性的堿基配對結合，從而對基因進行轉錄后表達的調控[2]。microRNA廣泛參與機體發育、細胞增殖、細胞凋亡等一系列生物學過程，與腫瘤的發生、發展密切相關[3-5]，某些microRNA 通過抑制靶基因的表達，在腫瘤發生、發展及侵襲轉移中發揮著關鍵作用[6-10]。microRNA-29c是microRNA-29家族中的一員[11]，其在眾多實體腫瘤如鼻咽癌、神經膠質瘤、胃癌、肝細胞癌、膀胱癌及結腸癌中均呈低表達，作為抑癌基因存在，最近的研究發現，microRNA-29c在裸鼠模型中抑制胰腺癌肝轉移并影響生存率[12]。本研究通過體外細胞實驗分析microRNA-29c對胰腺癌細胞侵襲轉移能力的影響，從而揭示microRNA-29c在胰腺癌細胞侵襲轉移中的作用。

1　材料與方法

1.1細胞株及主要試劑

人正常胰腺上皮細胞HPDE，人胰腺癌細胞AsPC-1、BxPC-3、PANC-1及MIA PaCa-2獲贈于華中科技大學附屬同濟醫院膽胰外科實驗室。胎牛血清購自gibico，RNA 抽提試劑TRIzol 購自Invitrogen 公司，逆轉錄試劑盒、SYBR Premix ExTaq 試劑盒均購自TaKaRa 公司。microRNA-29c 腺病毒過表達載體的構建、腺病毒包裝與滴度檢測由山東維真生物科技有限公司完成。microRNA-29c的逆轉錄引物及real-time PCR 引物套裝購自廣州銳博公司，E-cadherin、Vimentin、GAPDH一抗購自武漢三鷹有限公司，鼠抗和兔抗二抗購自博士德公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養胰腺正常上皮細胞HPDE，人胰腺癌細胞AsPC-1及BxPC-3用含10% 胎牛血清的RPMI1640 培養基培養；人胰腺癌細胞PANC-1及MIA PaCa-2用含10%胎牛血清的RPMI DMEM培養基培養；于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養。

1.2.2microRNA-29c在胰腺癌細胞系中的表達用TRIzol試劑盒根據操作說明提取各細胞系細胞的總RNA，測定總RNA濃度，采用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)各組胰腺癌細胞的表達，相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

1.2.3microRNA-29c腺病毒感染胰腺癌細胞將PANC-1 和MIA PaCa2細胞分別分為microRNA-29c感染組(實驗組)和空載體組(陰性對照組)，根據腺病毒操作手冊查得胰腺癌細胞PANC-1 和MIA PaCa2的慢病毒感染復數(MOI)值，取對數生長期細胞2 ×105個接種于6孔板中，待細胞貼壁后根據MOI值在實驗組的PANC-1 和MIA PaCa2細胞加入適量的腺病毒液，培養箱中培養12 h后換液處理，根據后續實驗需要進行相應處理。陰性對照組組則加入等量的空載體

1.2.4劃痕實驗感染腺病毒72 h后收集兩組細胞，按第2天可長滿12孔細胞培養板數量種于12孔細胞培養板中，待細胞長滿培養板后準備劃痕，更換無血清培養基分別培養，于0、24及48 h分別采用顯微鏡觀察細胞的遷移情況，取4個視野尺寸進行數據統計。

1.2.5Transwell 侵襲實驗感染腺病毒72 h后收集兩組細胞,用無血清的培養基制成單細胞懸液，按1 ×108個/L 的細胞密度加200 μL 細胞懸液至已經鋪好matrigel膠Transwell 上室中，下室加入含10%血清的DMEM 培養液800 μL，7 ℃孵育24 h 后，酒精棉球拭去上室未侵襲的細胞，經4%多聚甲醛固定30 min后,1%結晶紫染色30 min。采用顯微鏡觀察細胞的侵襲情況，隨機選取3個高倍(×100) 視野拍照計數。

1.2.6波形蛋白(Vimentin)及E-鈣粘蛋白(E-cadherin)表達Western blot法檢測，感染腺病毒72 h后收集PANC-1細胞，使用BCA法測蛋白濃度后按50 μg上樣量計算得出上樣體積，SDS-凝膠電泳，孵育GAPDH(1∶10 000)、Vimentin(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 000)一抗4 ℃搖床過夜，室溫孵育二抗2 h后用ECL化學發光試劑曝光。

1.3統計學處理

2　結果

2.1microRNA-29c在人胰腺癌細胞株中的表達

microRNA-29c在PANC-1、BxPC-3、MIA PaCa-2及AsPC-1細胞的表達明顯低于HDPE細胞，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.2microRNA-29c抑制胰腺癌細胞的侵襲和轉移

Transwell 小室細胞侵襲實驗結果顯示:實驗組PANC-1 和MIA PaCa2 細胞侵襲能力明顯受到抑制，細胞侵襲數量明顯少于陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。細胞劃痕實驗發現，感染腺病毒48 h后實驗組PANC-1、MIA 、PaCa-2細胞的遷移距離明顯短于陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

與HPDE比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01圖1　microRNA-29c在HPDE、PANC-1、BxPC-3、MIAPaCa-2及AsPC-1細胞系中的表達Fig.1　Relative expression of microRNA-29c in HPDE, PANC-1, BxPC-3, MIA PaCa-2, AsPC-1 cells

(1)與陰性對照組比較，P<0.05圖2　microRNA-29c 對PANC-1及MIA PaCa-2細胞侵襲能力的影響Fig.2　microRNA-29c inhibited PANC-1 and MIA PaCa-2 cell invasion ability

圖3　microRNA-29c 對PANC-1及MIA PaCa-2細胞遷移能力的影響Fig.3　microRNA-29c inhibited PANC-1 and MIA PaCa-2 cells migration ability

2.3Vimentin及E-cadherin蛋白表達

Western blot實驗結果顯示，過表達microRNA-29c后，PANC-1細胞波形蛋白Vimentin表達減少，E-cadherin表達增加，提示microRNA-29c過表達抑制胰腺癌細胞的侵襲轉移，見圖4。

圖4　microRNA-29c對PANC-1細胞中Vimentin及E-cadherin表達的影響Fig.4　microRNA-29c effect on Vimentin and E-cadherin expression in PANC-1 cell

3　討論

腫瘤治療失敗的主要原因在于腫瘤轉移，腫瘤細胞通過從原位突破基底膜進入血液或者淋巴循環，最后種植到遠處器官。胰腺癌在癌癥早期就極易發生遠處的侵襲和淋巴結轉移并且對傳統的化療藥物耐藥，是預后最差的惡性腫瘤之一。胰腺癌的侵襲轉移機制目前并不完全清楚，研究認為microRNA在胰腺癌中的表達異常對胰腺腫瘤細胞的侵襲和轉移具有重要影響。Moriyama 等[13]研究發現microRNA-21與MMP2/9或VEGF等侵襲轉移相關基因在胰腺癌中的表達成正比，抑制microRNA-21的表達能起到抑制胰腺癌侵襲轉移的作用，提示microRNA-21的表達失衡對胰腺癌的侵襲轉移有重要的影響。microRNA-224和microRNA-486均能靶向調控CD40,抑制其在高侵襲轉移的胰腺導管腺癌中表達，從而抑制胰腺癌侵襲轉移[14]。研究發現胰腺癌細胞中的相關microRNA的異常表達與其侵襲轉移相關。microRNA-29c在絕大多數腫瘤中低表達，前期研究發現，microRNA-29c在胰腺癌中低表達，而低表達的microRNA-29c可能與胰腺癌發生發展相關。

本研究通過腺病毒載體感染胰腺癌細胞獲得高表達microRNA-29c的細胞株后，通過transwell實驗模擬腫瘤細胞外環境，檢測其侵襲轉移能力，發現上調microRNA-29c表達水平后胰腺癌PANC-1及MIA PaCa-2細胞侵襲轉移能力明顯減弱，細胞劃痕實驗也同時證實上調microRNA-29c表達后胰腺癌PANC-1及MIA PaCa-2細胞遷移能力明顯受到抑制。同時western blot對EMT相關蛋白表達水平進行檢測，結果顯示microRNA-29c上調胰腺癌細胞后，E-cadherin表達增多，Vimentin表達減少，證實了microRNA-29c能夠抑制胰腺癌細胞的侵襲轉移過程以及上皮間質轉化過程，推測這可能與microRNA-29c參與調控腫瘤細胞EMT相關信號通路有關。

綜上，本研究發現microRNA-29c的過表達可有效抑制胰腺癌細胞的侵襲與轉移, microRNA-29c在胰腺癌中的調控可能為胰腺癌的基因診斷和生物靶向治療提供新的思路，但microRNA-29c在胰腺癌中的具體作用機制需要進一步深入研究。

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(2016-05-23收稿，2016-08-24修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 趙毅

Study on microRNA-29c Inhibition Effect and Mechanism on Human Pancreatic Cancer Cells Migration

ZHOU Xianfei, TIAN She, WANG Jie, JIA Liangliang, YU Chao, JIANG Jianxin

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004，Guizhou，Chnia)

Objective: To investigate the effect of microRNA-29c on the biological characteristics of human pancreatic cancer cells(AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2). Methods: Culturing 1 normal HPDE and 4 pancreatic cancer cells(AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2). The different expression of microRNA-29c in human pancreatic cancer lines were observed by real time RT-PCR. microRNA-29c infected PANC-1 and MIA PaCa2 cells as experiment group, lip-null infected PANC-1 and MIA PaCa2 cells as negative control group; wound healing experiment, Transwell method to test the vitro invasion of both group cells; Western blot was used to measure the change of epithelial-mesenchymal transition (EMT) associated protein Vimentin and E-cadherin. Results: The result of real time RT-PCR showed that microRNA-29c expression in human pancreatic cancer cell lines were significantly lower than that in the normal pancreatic ductal epithelial cells (HPDE)(P<0.05); wound healing experiment discovered that 48 hr after infection, PANC-1 and MIA PaCa-2 cells in experiment group migrated obviously shorter than that of negative control group(P<0.05). TRanswell experiment discovered PANC-1 and MIA PaCa-2 cells in experiment group invasion number was obviously shorter than that of negative control group(P<0.05). Western blot indicated after overexpression microRNA-29c of PANC-1 and MIA PaCa-2 cells, Vimentin expression reduced and E-cadherin expression increased. Conclusion: The over-expression of microRNA-29c can effectively suppress the invasion metastasis human pancreatic cancer cells, indicating it might be a potential biological therapeutic target for pancreatic cancer.

micro RNA; microRNA-29c; pancreatic cancer; adenovirus； cell invasion; metastasis; wound healing experiment

國家國際科技合作專項資助(2014DFA31420); 國家自然科學基金資助項目(81160311)

E-mail:jjx731003@163.com

R735.9

A

1000-2707(2016)09-0997-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.002

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網絡出版時間：2016-09-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.024.html