支架內血栓與CYP2C19*2、CYP2C19*3基因多態性的相關性研究

孟　帥　李　紅　金澤寧首都醫科大學附屬北京安貞醫院 北京市心肺血管疾病研究所急診危重癥中心，北京　100029

支架內血栓與CYP2C19*2、CYP2C19*3基因多態性的相關性研究

孟帥李紅金澤寧
首都醫科大學附屬北京安貞醫院 北京市心肺血管疾病研究所急診危重癥中心，北京100029

目的 探討冠脈介入治療后支架內血栓形成與CYP2C19基因多態性的相關性。方法 回顧性單中心研究，入選2000～2015年首都醫科大學附屬北京安貞醫院急性冠脈綜合征患者120例，其中，冠脈介入術后支架內血栓形成（ST組）40例，對照組80例為冠脈介入術后支架內未形成血栓。給予充分氯吡格雷治療后，進行基因多態性檢測。結果 CYP2C19*2基因分布（G/G、A/A、G/A）在ST組中為5例（12.5%）、30例（75.0%）、5例（12.5%），對照組為37例 （46.2%）、42例 （52.5%）、1例 （1.3%）；攜帶等位基因A突變率為87.50%比53.75%（P＜0.05）。CYP2C19*3基因分布（G/G、A/A、G/A）在 ST組中為39例（97.5%）、1例（2.5%）、0例（0.0%），對照組為 80例（100.0%）、0例（0.0%）、0例（0.0%）；攜帶等位基因A突變率為2.5%比0.0（P＞0.05）。ST組與對照組相比低密度脂蛋白水平差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 支架內血栓形成與CYP2C19*2基因突變有相關性，支架內血栓形成與CYP2C19*3基因突變關系尚不明確，低密度脂蛋白水平升高可以影響支架內血栓形成。

支架內血栓形成；氯吡格雷抵抗；CYP2C19基因多態性

［Abstract］Objective To investigate the relationship of coronary intervention stent thrombosis with CYP2C19 gene polymorphism.Methods As retrospective single center study，a total of 120 patients with acute coronary syndrome from 2000 to 2015 in Beijing Anzhen Hospital，Capital Medical University were selected.40 patients had coronary intervention stent thrombosis were taken as the ST group.80 patients without stent thrombosis after percutaneous coronary intervention were taken as the control group.After the patients received adequate Clopidogrel pretreatment，all of them were accepted detection of gene polymorphism.Results G/G，A/A，G/A genotype frequencies of CYP2C19*2 were 5 cases（12.5%），30 cases（75.0%），5 cases（12.5%）in the ST group；which were 37 cases（46.2%），42 cases（52.5%），1 case（1.3%）in the control group；the mutation rate of A was 87.5%vs 53.75%（P＜0.05）.G/G，A/A，G/A genotype frequencies of CYP2C19*3 were 39 cases（97.5%），1 case（2.5%），0 case（0.0%）in the ST group；which were 80 cases（100.0%），0 case（0.0%），0 case（0.0%）in the control group；the mutation rate of A was 2.5%vs 0.0%（P＞0.05）.The level of low density lipoprotein had significantly statistically difference between the ST group and the control group（P＜0.05）.Conclusion Stent thrombosis has correlation with CYP2C19*2 gene mutations，but the relationship of stent thrombosis with CYP2C19*3 gene mutations is still unclear.Low density lipoprotein levels can affect stent thrombosis.

［Key words］Stent thrombosis；Clopidogrel resistance；CYP2C19 genetic polymorphism

經皮冠狀動脈介入治療 （percutaneous coronary intervention，PCI）已經成為目前治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的主要手段。PCI后支架內血栓形成直接影響患者預后，增加死亡率及再住院率，對社會造成巨大的經濟負擔［1］。冠脈介入術后支架內血栓形成分為急性（＜1 d）、亞急性（＞1 d～1個月）、晚期（＞1個月～1年）和極晚期（＞1年）［2］。影響支架內血栓形成的因素較多，如支架貼壁不良、血液病、藥物抵抗等，其中，氯吡格雷抵抗為主要因素［3］，發生率為4.2%～27.8%［4］。氯吡格雷屬于噻吩吡啶類藥物，是一種前體藥物，經過CYP轉化成活性代謝產物。細胞色素P450 CYP2C19酶是氯吡格雷轉化過程中的關鍵酶，故CYP2C19基因的多態性與氯吡格雷抵抗密切相關［5-7］。本實驗回顧性分析支架內血栓形成與CYP2C19基因多態性的相關性。

1　資料與方法

1.1一般資料

本實驗為回顧性單中心研究，入選2000～2015年首都醫科大學附屬北京安貞醫院（以下簡稱“我院”）120例急性冠脈綜合征（ACS）患者，其中，PCI后支架內血栓形成患者40例作為支架內血栓組（ST組），其他80例患者作為對照組，臨床情況與ST組患者類似，既往診斷為ACS并行PCI后未發生ST及其他不良心血管事件（心源性死亡、非致死性心肌梗死、腦卒中、大出血）。所有患者年齡25～75歲。入選標準：ACS患者每日接受阿司匹林100 mg，氯吡格雷75 mg時間＞3 d，并接受CYP2C19*2和*3基因檢測；ACS診斷依據2007年ACC/AHA標準，其中包括不穩定性心絞痛（UA）、ST段抬高性心肌梗死（STEMI）、非ST段抬高性心肌梗死（NSTEMI）。排除標準：對阿司匹林及氯吡格雷過敏者，出血或有出血傾向者，長期口服抗凝藥物（如華法令等）者，存在抗血小板治療禁忌者，重度貧血者（＜60 g/L），腎功能不全者（血肌酐＞220 μmol/L），心力衰竭者（NYHA分級Ⅳ），嚴重免疫系統疾病者。本實驗經我院倫理委員會審批通過。

1.2基因多態性測定

患者服藥至少3 d后抽取清晨空腹靜脈血2 mL（EDTA-Na2抗凝）。標本送往我院檢驗科進行CYP2C19*2和 *3單核苷酸多態性檢測，檢測CYP2C19*2和*3等位基因為野生純合GG、雜合突變GA還是純合突變AA。

1.2.1全血基因組DNA提取采用小量全血基因組DNA快速提取試劑盒從全血細胞中提取基因組DNA，通過裂解細胞、吸附及漂洗核酸、收集核酸三步提取DNA，保證DNA濃度為5～10 ng/μL，并采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進行DNA完整性檢測。所需試劑盒由北京Aidlab公司提供。

1.2.2引物的設計與合成在NCBI公共數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中檢索CYP2C19*2、CYP2C19*3并下載基因序列，采用Primer 5.0軟件設計引物。采用上海生工生物工程有限公司所提供試劑合成引物。1.2.3 PCR擴增目的片段采用25 μL PCR反應體系進行DNA擴增，所需試劑由大連寶生物公司提供。PCR熱循環反應括：94℃預變性，94℃變性、退火，72℃延伸及72℃充分延伸5步，共30個循環。采用PCR熱循環儀MyGeneTMSeries Peltier Thermal Cycler（杭州朗基科學儀器有限公司）進行目的片段擴增。不同SNP位點退火溫度不同，見表1。

表1　CYP2C19*2、CYP2C19*3引物序列及褪火溫度

1.2.4擴增產物測序擴增反應結束后，產物采用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，采用基因測序儀3730xl DNA Analtzer（美國AB公司）進行測序，采用Chromax軟件輸出結果。

1.3統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1基線臨床資料

臨床資料比較顯示，兩組性別、年齡、BMI、吸煙、高血壓、糖尿病、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、三酰甘油（TG）水平差異均無統計學意義（P＞0.05）；ST組低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2　兩組患者臨床資料比較

2.2基因測序結果比較

2.2.1CYP2C19*2基因測序情況結果表3顯示，兩組間CYP2C19*2基因型分布存在差異。兩組患者CYP2C19*2基因型等位基因基因頻率對比顯示，兩組間CYP2C19*2等位基因基因頻率及患者中突變基因攜帶率差異有統計學意義（P＜0.05），ST組CYP2C19*2等位基因的突變率高于對照組。見表4。

表3　兩組患者CYP2C19*2基因型對比［n（%）］

表4　兩組患者CYP2C19*2突變等位基因基因頻率對比［n（%）］

2.2.2CYP2C19*3基因測序情況結果表5顯示，兩組間CYP2C19*3基因型分布差異不大。兩組患者CYP2C19*3基因型等位基因基因頻率對比顯示，兩組間CYP2C19*3等位基因基因頻率及患者中突變基因攜帶率差異無統計學意義（P＞0.05）。見表6。

表5　兩組CYP2C19*3基因型對比［n（%）］

表6　兩組患者CYP2C19*3突變等位基因基因頻率對比［n（%）］

3　討論

氯吡格雷是血小板表面P2Y2受體抑制劑，其吸收局限于小腸上皮的流出轉運體P糖蛋白，吸收后85%經酯酶水解成帶有羧基的活性代謝產物，15%經肝細胞色素P450系統代謝，其中，CYP2C19酶起主要作用［8］。CYP2C19基因編碼CYP2C19酶。CYP2C19基因具有多態性，分為有功能性及無功能性變異。已有研究表明，氯吡格雷抵抗與CYP2C19基因多態性相關［9-12］，但支架內血栓形成與CYP2C19多態性是否相關有待進一步探討［13］。故本實驗通過比較支架內血栓組與對照組，探討CYP2C19基因多態性是否與血栓形成相關。

本研究中入選120例患者，通過對臨床資料及CYP2C19*2和*3基因多態性檢測對兩組進行研究。本實驗證實ST組CYP2C19*2突變基因A的攜帶率高于對照組（86.7%比53.3%，P=0.002）。已有研究顯示，氯吡格雷抵抗患者心血管事件發生率增加［14-16］。由于CYP2C19突變可以降低酶的活性從而減弱氯吡格雷代謝從而引起血小板反應性增加，促使血栓形成［17］。本實驗 ST組 CYP2C19*2突變率高，證實CYP2C19*2突變是支架內血栓形成的危險因素。本研究顯示，ST組CYP2C19*3突變基因A的攜帶率與對照組比較無統計學差異（P＞0.05）。由于目前對于CYP2C19*3突變是否與氯吡格雷抵抗，乃至于支架內血栓形成有關尚存在爭議［18-19］，故本結論有待擴大樣本后進一步研究。本實驗臨床資料分析表明，ST組LDL-C水平升高，提示LDL-C可以預示血栓形成情況，LDL-C可能與CYP2C19基因多態性相關［20］。

本研究作為單中心研究存在一定局限性，同時由于樣本量受限，可能對結果造成一定影響，故有待于多中心大樣本研究分析支架內血栓形成與CYP2C19基因多態性的相關性。

綜上所述，由于支架內血栓形成的致殘率及病死率較高，預防及減少支架內血栓形成勢在必行。本實驗結果顯示，ST組LDL-C水平明顯高于對照組，故控制LDL-C水平也許可以降低支架內血栓發生率。同時，ST組 CYP2C19*2基因突變率較高，提示CYP2C19*2基因突變對支架內血栓形成的預測作用。但由于本實驗局限性，故其作用機制有待進一步研究。

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Relationshipbetweenstentthrombosisandgenepolymorphismof CYP2C19*2，CYP2C19*3

MENG ShuaiLI HongJIN Zening
Department of Emergency Medicine，Beijing Anzhen Hospital，Capital Medical University Beijing Institute of Heart，Lung and Blood Vessel Diseases，Beijing100029，China

R541

A

1674-4721（2016）08（b）-0079-04

2016-05-10本文編輯：程銘）

北京市衛生系統高層次衛生技術人才培養計劃（2015-3-055）。

金澤寧（1972.10-），男，博士，主任醫師，教授，碩士研究生導師；研究方向：心血管介入治療。