抗生素耐藥基因位點和藥物代謝酶聯合檢測在幽門螺桿菌根除治療中的應用

林　勇　李榮洲　鄭煒峰　金培聲　任宗海浙江省瑞安市人民醫院消化內科，浙江溫州　325200

抗生素耐藥基因位點和藥物代謝酶聯合檢測在幽門螺桿菌根除治療中的應用

林勇李榮洲鄭煒峰金培聲任宗海
浙江省瑞安市人民醫院消化內科，浙江溫州325200

目的 分析溫州地區幽門螺桿菌（Hp）對克拉霉素和左氧氟沙星的耐藥情況及相關耐藥基因突變特征，同時檢測患者的藥物代謝酶CYP2C19的代謝類型。通過綜合分析藥物代謝酶和耐藥位點突變情況為臨床Hp個體化治療提供理論依據。方法 選擇2015年1～3月在瑞安市人民醫院經胃鏡和病理檢查確診的慢性胃炎患者116例，其中男67例，女49例，年齡24～76歲，平均（43.8±5.3）歲。采用E-test法測定Hp對克拉霉素和左氧氟沙星的最低抑菌濃度（MIC），耐藥判定標準：克拉霉素MIC＞1 μg/mL，左氧氟沙星MIC＞1 μg/mL。提取Hp基因組DNA，采用PCR法擴增23S rRNA和gyrA基因片段，并對擴增產物進行測序。個體CYP2C19代謝類型的測定同樣采用PCR擴增和測序的方法。 結果 34株克拉霉素耐藥Hp菌株的23S rRNA V區均有基因突變發生，突變位點A2143G最為常見，突變率達到91.17%。左氧氟沙星耐藥Hp菌株的gyrA基因最常見的突變方式為N87K（56.76%）。個體藥物代謝酶類型主要為快代謝和中代謝類型。結論23S rRNA基因的突變位點A2143G是導致Hp對克拉霉素耐藥的主要原因。gyrA基因的87和91位氨基酸突變是導致Hp對左氧氟沙星耐藥的主要原因。臨床Hp根除治療應適時采用高通量檢測技術提高個體化用藥效能。

幽門螺桿菌；耐藥；測序；CYP2C19

［Abstract］Objective To investigate drug resistance of Helicobacter pylori（Hp）strains to levofloxacin and clarithromycin in Wenzhou district，and to detect the type of CYP metabolism，so as to provide theoretical basis for clinical anti-Hp treatment.Methods 116 patients with chronic gastritis were selected in Rui′an People's Hospital from January 2015 to March 2015 and their diagnosis under gastroscope and pathology were analyzed.The patients included 67 cases of male，50 cases of female，aged from 24 to 76 years old，average（43.8±5.3）years old.Minimum inhibitory concentration（MIC）values for clarithromycin and levofloxacin resistance in Hp were tested by E-test method.Genomic DNA of Hp was extracted，followed by PCR amplification and DNA sequencing for 23S rRNA and gyrA fragments.Determination of CYP2C19 metabolism type was also performed by the methods of PCR amplification and sequencing.Results 34 Clarithromycin resistant Hp strains showed mutations in the 23S rRNA V region，most commonly seen at Site A2143G（91.17%）.Gene gyrA of the levofloxacin-resistant strains was mostly mutated as N87K（56.76%）.The types of individual drug metabolizing enzymes were mainly fast metabolism and medium metabolism.Conclusion A2143 mutation of 23S rRNA leads to the Hp resistance to clarithromycin.The 87 and 91 amino acid mutations of gyrA gene are the main reasons for the Hp strains resistance to levofloxacin.The eradication therapy of Hp infection should be based on the high throughput detection technology to improve the effectiveness of individual drug use.

［Key words］Helicobacter pylori；Drug resistance；Sequencing；CYP2C19

抗生素濫用與幽門螺桿菌 （Helicobacter pylori，Hp）耐藥在我國是普遍存在且非常嚴重的問題。遏制Hp耐藥發展、保證抗菌藥物的療效已經到了刻不容緩的時刻。目前，影響Hp感染個體化根除治療療效的因素主要包括三方面：宿主、Hp和抗生素。宿主主要包括CYP2C19的基因多態性會明顯影響質子泵抑制劑（proton pump inhibitors，PPI）代謝水平及抑酸效果，對Hp根除療效產生影響［1］；Hp因素主要為Hp對抗生素的耐藥性，其中又以三聯療法中克拉霉素和左氧氟沙星的耐藥為主［2］；抗生素因素主要包括抗生素的藥物劑量、服用頻率、療程等因素的影響。本文采用藥敏實驗E-test法和PCR產物測序法對Hp臨床分離株進行了克拉霉素和左氧氟沙星的耐藥檢測并同時檢測了患者CYP2C19的代謝類型，通過二者聯合檢測指導臨床Hp根除治療過程中的合理用藥。

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇2015年1～3月在瑞安市人民醫院經胃鏡和病理檢查確診的慢性胃炎患者116例，其中男67例，女49例，年齡24～76歲，平均（43.8±5.3）歲。所有患者1個月內均未服用任何抗Hp治療藥物。胃竇黏膜標本經快速尿素酶實驗證實Hp陽性。胃竇黏膜組織立即放入1 mL的腦心浸出液（BHI）液體培養基（杭州致遠醫學檢驗所有限公司）中，-80℃保存備用。本研究方案通過醫院倫理委員會審核，納入研究前所有患者均簽署知情同意書。根據藥物靶點分析得知，常見幾種用于根除Hp感染的抗生素，其作用靶蛋白所富集開發的藥物多為以下疾病治療藥物，排除此類病例入組就減少了藥物副作用發生的可能［3］。排除標準：心血管疾病患者、哮喘患者、糖尿病患者、神經系統疾病患者、近期服用其他藥物患者。

1.2方法

1.2.1藥敏實驗分離培養Hp菌株，采用E-test法測定Hp對克拉霉素和左氧氟沙星的最低抑菌濃度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）。耐藥判定標準：克拉霉素MIC＞1μg/mL，左氧氟沙星MIC＞1μg/mL。1.2.2 PCR擴增及耐藥位點測序采用細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）按照說明書步驟提取Hp基因組DNA。分別擴增Hp克拉霉素耐藥基因23S rRNA、左氧氟沙星耐藥基因gyrA。擴增引物由杭州致遠醫學檢驗所有限公司合成，詳細見表1。PCR反應體系50 μL：DNA模板5 μL，500 nmol/L上下游引物，1U rTag酶，200 μmol/L dNTP，1×PCR buffer，ddH2O 29 μL。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性 30 s、52℃退火30 s、72℃延伸30 s循環35次，72℃延伸5 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技有限公司），對PCR產物切膠回收純化后，送軍事醫學科學院采用Illumina HiSeq2000測序儀測序。結果與Hp標準菌株26695序列進行比對。見表1。

表1　PCR擴增引物序列

1.2.3藥物代謝酶CYP2C19 PCR擴增及測序PCR引物 CYP2C19*2位點擴增的正向引物：AATTACAACCAGAGCTTGGC；反向引物：TATCACTTTCCATAA AAGCAAG；CYP2C19*3位點擴增的正向引物：TAT TATTATCTGTTAACTAATATGA； 反向引物：ACTTCAGGG CTTGGTCAATA。經PCR擴增，得到目標片段長度：CYP2C19*2為 166 bp，CYP2C19*3為327 bp。PCR產物進行切膠回收純化后，送軍事醫學科學院測序。

1.3確定基因型

測序結果與人類基因庫中的 CYP2C19*2、CYP2C19*3基因序列比對，確定待測突變位點上的基因型。

2　結果

2.1HP藥敏檢測實驗

本次研究共成功分離出107例Hp菌株，其中13例對克拉霉素耐藥，16例對左氧氟沙星耐藥，21例對克拉霉素和左氧氟沙星雙重耐藥，剩余57例為敏感菌株。具體突變特征見表2。

表2　Hp耐藥位點突變特征

2.2Hp耐藥基因突變特征分析株

從測序結果可以看出，34株克拉霉素耐藥Hp菌株的23S rRNA V區均有突變發生，突變位點A2143G較常見［4］，突變率達91.17%，其他依次為A2174G（5.88%）、A2187G（2.95%）。37例Hp臨床分離株經PCR均擴增出gyrA基因中含喹諾酮類耐藥決定區的目的片段。測序結果顯示，37株左氧氟沙星耐藥Hp菌株的gyrA基因突變方式主要為N87K（56.76%）［5］，其他依次為N87I（16.22%）、D91N（21.62%）和D91G（5.40%）。57例敏感菌株中未發現突變位點。

2.3藥物代謝酶CYP2C19測序分析

根據CYP2C19的遺傳多態性可把其分為兩種表型，即強代謝型和弱代謝型［6］。其中強代謝型根據基因型的不同又可被分為純合子強代謝型和雜合子強代謝型即中間代謝型。通過對107例樣CYP2C19*2和CYP2C19*3位點進行測序，部分測序圖譜見圖1，測序結果分析如下：

圖1　CYP2C19測序圖譜分析

2.3.1 CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型在測序樣本中的分布在107例樣本中，21例為野生型純合子，占比19.63%。55例只有一種基因發生雜合突變（*1/*2、*1/*3），為中間代謝型。其中*1/*2型45例，*1/*3型10例。一種基因發生純合突變或兩種基因均發生雜合突變者31例，為慢代謝人群，其中*2/*2型9例，*2/*3型21例，*3/*3型1例。見表3。

2.3.2CYP2C19*2和CYP2C19*3基因突變情況的分析 在107個樣本中，發生于681位點的突變（GA和AA）較常見（n=75，70.09%）。其中以雜合突變居多（n=66，61.68%）。純合突變9例，占比8.41%。636位點雜合突變31例，占比28.97%；發生在636位點的純合突變概率較低（n=1），占比0.93%。

表3　CYP2C19基因多態性分布統計

3　討論

目前臨床用于Hp根除治療的抗生素主要有甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、慶大霉素、呋喃唑酮［7］。PPI主要包括奧美拉唑、蘭索拉唑、雷貝拉唑、埃索美拉唑［8］。

在Hp根除的三聯療法中，由于患者個體間藥物代謝酶代謝能力的差異，導致個體對PPI的治療效果差異較大。在浙江地區，Hp對抗生素的耐藥主要集中在甲硝唑、克拉霉素和左氧氟沙星三種藥物上［9］。甲硝唑的耐藥率達90%以上，已不適合作為臨床根除Hp治療藥物。浙江地區Hp根除治療過程中主要考慮為克拉霉素和左氧氟沙星耐藥。

有研究表明，克拉霉素耐藥的主要原因是由于23S rRNA基因突變導致［10］。23S rRNA基因最常見突變位點主要包括A2142和A2143位點［11］。在本研究中，A2142位點并未發生突變，主要突變位點為A2143位點，說明浙江地區克拉霉素耐藥主要是由于A2143位點突變導致。左氧氟沙星耐藥主要是由于gyrA基因突變導致，突變主要發生在第87和91位氨基酸［12］。37株左氧氟沙星耐藥Hp菌株的gyrA基因突變最常見的突變方式為N87K（56.76%），其他依次為N87I（16.22%）、D91N（21.62%）和D91G（5.40%）。

對107例樣本的藥物代謝酶CYP2C19進行測序分析發現強代謝和中等代謝型共占比近70%，慢代謝型占30.99%。提示大部分人群服用正常劑量PPI后，由于藥物代謝較快，體內血藥濃度維持時間不長，根除治療達不到理想效果。對于強代謝型患者，要增加PPI給藥劑量而不是增加抗生素給藥劑量，在一定時間內保持PPI體內的血藥濃度以提高Hp的根除率［13］。抗菌藥物的作用機制為直接殺滅Hp，PPI通過增加胃內PH值，通過多種機制改善抗生素的抗菌療效，延長抗菌藥物半衰期并提高穩定性，具有特異性抗Hp作用，和抗生素具有協同作用［14］。PPIs中只有雷貝拉唑通過肝內的非酶途徑代謝，即通過與葡萄醛酸結合和形成硫醚醛酸后由尿排泄，與絕大多數藥物無藥動學相互作用，僅影響少數依賴胃酸吸收的藥物，故在臨床上更為安全、穩定［15-28］。對于浙江地區的PPI使用，應該首先考慮雷貝拉唑的使用或者對經CYP2C19代謝的PPI藥物臨床使用要適當增加劑量以確保抑酸效果。

綜上所述，臨床Hp個體化根除治療適時應采用高通量測序技術檢測Hp對抗生素的耐藥性并同時檢測個體藥物代謝酶CYP2C19的代謝類型，根據Hp菌株對抗生素的耐藥情況和個體CYP2C19的代謝類型合理選用抗生素和PPI以提高臨床Hp根除療效。

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Application of combined detection of antibiotic resistance gene loci and CYP2C19 in helicobacter pylori eradication therapy

SHI ZhengchaoYU MingLI KechengLIN YongLI RongzhouZHENG WeifengJIN PeishengREN Zonghai
Department of Gastroenterology，Rui′an People's Hospital，Zhejiang Province，Rui′an 325200，China

R978.1

A

1674-4721（2016）08（b）-0020-05

2016-04-20本文編輯：趙魯楓）

浙江省溫州市科技計劃項目（Y20140271）。