核因子-κB在慢性髓細胞白血病急變期前后的變化

艾克拜爾·阿布都熱衣木　徐　麗　阿依姆妮薩·阿卜杜熱合曼　海熱薩·阿布力米提　劉加軍.新疆維吾爾自治區喀什地區第一人民醫院血液科，新疆喀什　844000；2.中山大學血液病研究所，廣東廣州　50630

核因子-κB在慢性髓細胞白血病急變期前后的變化

艾克拜爾·阿布都熱衣木1徐麗1阿依姆妮薩·阿卜杜熱合曼1海熱薩·阿布力米提1劉加軍2▲
1.新疆維吾爾自治區喀什地區第一人民醫院血液科，新疆喀什844000；2.中山大學血液病研究所，廣東廣州510630

目的 探討核因子-κB（NF-κB）在慢性髓細胞白血病（CML）急變期前后的表達及意義。方法 選擇2011年2月～2013年2月于新疆喀什人民醫院血液科住院治療的25例慢性髓細胞白血病慢性期 （CML-CP）（CML-CP組）、16例慢性髓細胞白血病急變期（CML-BC）患者（CML-BC組）、30例缺鐵性貧血或巨幼細胞性貧血患者（對照組）為研究對象。采用凝膠遷移或電泳遷移率實驗檢測三組人骨髓細胞中NF-κB的表達。結果 對照組患者的NF-κB活性測定均為陰性，CML-CP組也僅4例患者檢測到NF-κB活性增強，CML-BC組14例患者的NF-κB活性增強。CML-BC組患者NF-κB活化率明顯高于CML-CP組及對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；CML-CP組活化率高于對照組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。CML-BC組患者NF-κB mRNA表達水平（22.91±0.15）明顯高于對照組（0）及CML-CP組（11.19±0.03），差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 與慢性髓細胞白血病慢性期比較，急變期NF-κB活性增強，表達增加，可作為慢性髓細胞白血病急性病變的重要標志物。

慢性髓細胞白血病；核因子-κB；慢性期；急變期

［Abstract］Objective To study the changes of the NF-kB in acute transformation phase of chronic myelogenous leukemia and its significance.Methods From February 2011 to February 2013，25 cases of chronic myelogenous leukemia（CML-CP）（CML-CP group）；16 cases of chronic myelogenous leukemia patients in the acute transformation phase（CML-BC）（CML-BC group）；and 30 patients with iron deficiency anemia or gigantic young cell anemia（control group）in Department of Hematology of First People's Hospital of Kashgar District were selected as the research objects. Expression of NF-κB in bone marrow cells of the three groups were tested by EMSA.Results Activity determination of NF-κB in the control group were all negative，NF-κB activity of 4 patients in the CML-CP group were increased，and NF-κB of 14 patients in the CML-BC group were activity.Activation rate of the CML-BC group was higher than that of CML-CP group and the control group，the differences were statistically significant（P＜0.05 or P＜0.01）；activation rate of the CML-CP group was higher than that of the control group，the difference was statistically significant（P＜0.01）. The expression level of the NF-κB mRNA in the CML-BC group（22.91±0.15）was significantly higher than that of control group（0）and CML-CP group（11.19±0.03），the differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion Compared with the chronic phase of chronic myelogenous leukemia，activity of NF-κB in the CML-BC phase was enhanced， the expression was increased，so NF-κB can be used as an important marker in predicting of CML-BP of chronic myelogenous leukemia.

［Keywords］Chronicmyelogenousleukemia；Nuclear factorkappaBpredominate；Chronicphase；CMLBC phase

核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）蛋白家族是一種廣泛存在于體內多種細胞的多效性蛋白質核轉錄因子，幾乎表達于所有細胞的蛋白復合體，可以與多種基因啟動子部位的κB位點發生特異性地結合從而促進其轉錄表達。當NF-κB被體內、外各因素誘導活化后，可轉移至胞核內參與轉錄調控與惡性病變有關的基因的表達，從而發揮介導惡性腫瘤的發生、增殖，甚至誘導化療及放療耐受，決定腫瘤的組織構成和誘發黏膜損傷等。因此NF-κB過度活化可引起多種病理生理反應，且在很多腫瘤的發展中也起著非常重要的作用，可持續激活許多類型的人類癌癥細胞［1］，與造血系統腫瘤如白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤、泌尿系統腫瘤的發生密切相關［2-5］。本研究通過凝膠遷移或電泳遷移率實驗 （Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）以及免疫熒光法檢測慢性髓細胞白血病慢性期（Chronic myelogenous leukemia-chronic phase，CML-CP）、慢性髓細胞白血病急變期 （CMLBC）以及非惡性血液系統疾病患者的NF-κB的表達，旨在探討NF-κB在慢性髓細胞白血病急變期前后的變化。

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇2011年2月～2013年2月新疆喀什人民醫院（以下簡稱“我院”）血液科住院的慢性髓細胞白血病患者。所有納入本研究的患者均為成年患者，且符合張之南主編的2007版《血液病診斷及療效標準》中的診斷標準。排除肝腎功能嚴重障礙者、心功能不全者、合并惡性腫瘤者、嚴重感染者。最終納入慢性髓細胞白血病慢性期病例25例，男15例，女10例；年齡19～65歲，年齡（42.8±12.7）歲；血紅蛋白水平為（59.2± 19.4）g/L。慢性髓細胞白血病急變期16例，男9例，女7例；年齡20～69歲，平均（39.5±10.2）歲；血紅蛋白水平（53.8±18.3）g/L。同時選擇我院同期其他科室診斷的非惡性血液病的缺鐵性貧血或巨幼細胞性貧血患者30例為對照組，男15例，女15例，年齡18～65歲，平均（32.7±6.9）歲，血紅蛋白水平（50.1±15.6）g/L。三組性別、年齡、血紅蛋白水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。所有納入對象均對研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2骨髓單個核細胞分離

無菌操作取骨髓8 mL，肝素（50 U/mL）抗凝，用等體積PBS液稀釋混勻，緩慢加入等體積人淋巴細胞分離液，-20℃下2000 r/min，離心15 min，取界面層骨髓單個核細胞（MNC），用PBS液洗滌2次，在顯微鏡下計數，臺盼藍拒染率大于99%。于同一標本中，取約2×107個細胞，-80℃凍存，用于提取核蛋白；另取約3×106個細胞，加TrizoL試劑（美國Invitrogen）1 mL，充分混勻之后，-80℃凍存，用于提取RNA。

1.3NF-κB活化檢測

應用EMSA方法進行NF-JB活化檢測［4］，主要步驟包括：①核蛋白抽提和活性測定；②雙鏈寡核甘酸探針制備：設計NF-κB特異結合探針，sense：5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3；antisense：3'-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5'；生物素進行5'端標記（上海博亞生物技術有限公司）；③DNA結合蛋白的凝膠電泳遷移測定：DNA/蛋白結合反應中，依次加入核蛋白5 μg，加水至20 μL，室溫下放置20 min，加12p-探針2 μL，室溫下放置30 min；上樣，凝膠電泳（電壓120 V）1 h，轉膜（100 V）45 s，紫外交聯10 s；④生物素自顯影；⑤在圖像分析處理系統上讀取灰度面積值分析蛋白結合性。

1.4統計學方法

采用SPSS10.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計量資料用方差分析。計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1三組骨髓細胞中NF-κB活化情況比較

EMSA法檢測各組NF-κB的活化水平結果顯示，對照組患者的NF-κB活性測定均為陰性，CMLCP組也僅 4例患者檢測到NF-κB活性稍增強，CML-BC組14例患者的NF-κB活性均增強。CMLBC組患者NF-κB活化率明顯高于對照組及CMLCP組，差異有統計學意義 （P＜0.05或P＜0.01）；CML-CP組NF-κB活化率高于對照組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1　三組骨髓細胞中NF-κB活化情況比較［n（%）］

2.2三組骨髓細胞中NF-κB mRNA表達水平

CML-BC組患者NF-κB mRNA表達水平明顯高于對照組及CML-CP組，差異有統計學意義 （P＜0.05）；CML-CP組NF-κB mRNA表達水平與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2　三組骨髓細胞中NF-κB mRNA表達水平（x±s）

3　討論

白血病是起源于造血干細胞的惡性克隆性腫瘤，死亡率極高，位居各類疾病死亡率的首位。其中白血病化療緩解后復發是導致其高死亡率的重要原因，有效評估白血病患者疾病進展對疾病的有效控制極為重要。NF-κB是1986年Sen等［6］首次從淋巴細胞提取物中檢測到的一種可與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強子κB序列特異性結合的核蛋白因子。NF-κB蛋白家族由NF-κB1（p50/p105）、NF-κB2（p52/p100）、RelA（p65）、RelB及c-Rel組成，其共同特點是擁有一個約有300個氨基酸組成的高度保守的Rel同源區，該區可與DNA結合、二聚體化、抑制性卡巴蛋白（IKB）相互作用及核定位信號區域。當NF在胞漿中與抑制性卡巴蛋白結合時處于非激活狀態，但能被腫瘤壞死因子、生長因子、氧化劑、病毒或藥物等激活劑激活［7-9］，被激活的κB與抑制性卡巴蛋白解離，同時p65上的NSL被釋放出來，促使p65/p50進入核內與靶基因的κB序列結合，形成NF-κB，導致表達及活性增強［10-11］。近年來，研究發現功能性NF-κB結合序列存在于多種細胞基因的啟動子和增強子中，多種致癌因素均可通過激活NF-κB促進細胞生長、抗凋亡，使細胞發生惡性轉化并促進腫瘤細胞的轉移［12-13］。鄭永亮等［14］收集急性白血病初治組、復發組和緩解組患者的骨髓及外周血標本，同時選取非惡性血液病患者作為對照。采用不同的實驗方法分別檢測了高遷移率蛋白B1（HMGB1）、NF-κB mRNA及蛋白質表達水平，結果發現在初治組與復發組骨髓單個核細胞中HMGB1、NF-κB表達水平較對照組明顯升高，而在緩解組未見明顯變化。結果提示HMGB1在急性白血病中過表達，它可能是通過激活NF-κB信號通路參與急性白血病的發生、發展。究其原因可能為NF-κB可激活細胞因子或其受體基因轉錄，從而促進非調節性淋巴細胞的生長或阻斷凋亡。馮金等［15］研究發現，白血病細胞中存在NF-κB的持續性激活，其激活可導致白血病細胞凋亡受阻。胡亮杉等［16］研究發現，姜黃素誘導前后HL-60細胞中抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl表達無明顯變化，促凋亡基因Bid和Bax表達增高，NF-κB mRNA和蛋白表達均增高，并呈劑量依賴性，可見姜黃素能誘導HL-60細胞凋亡并上調促凋亡基因Bid和Bax，這可能與NF-κB表達上調有關。此外，NF-κB還可直接作用于細胞周期或DNA復制，從而導致惡性腫瘤的發生。目前國內關于NF-κB在血液系統惡性腫瘤的研究主要集中在急性髓細胞性白血病以及彌漫性大B細胞淋巴瘤上［17-18］，而關于慢性髓細胞性白血病急變期前后是否有NF-κB的變化鮮有相關報道。因此本研究集中觀察NF-κB在慢性髓系白血病中的變化情況，以為后續研究做鋪墊。

本研究采用EMSA法檢測不同患者骨髓細胞中NF-κB的活化水平，結果顯示，16例CML-BC樣本中14例檢測到了NF-κB轉錄因子的持續性激活，而25例CML-CP樣本中僅4例樣本檢測到NF-κB活性稍稍增強，而30例對照組均僅檢測到NF-κB的基礎表達。在CML的慢性期中，NF-κB的低表達提示在CML中bcl-abl腫瘤蛋白的作用可能與NF-κB無關。而這一結果與此前Turhan等［19］和Reuther等［20］的研究結果相符合，他們的研究結果均認為，Bcr-Abl癌基因的抗凋亡活性在CML中與NF-κB無關，但CML急變期NF-κB有顯著性的高表達。同時本研究還對各組骨髓細胞中NF-κB mRNA表達水平進行了半定量分析，結果發現，CML-BC組患者NF-κB mRNA表達水平明顯高于對照組及CML-CP組，差異有統計學意義（P＜0.05），而CML-CP組NF-κB mRNA表達水平與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），進一步嚴驗證了NF-κB在CML慢性期呈低表達，而在CML急變期表達活性及表達量均顯著提高，與既往的大量研究結果相似［21-24］。劉婷婷等［25］的研究還對NF-κB基因表達與患者預后的關系進行了分析，結果發現，常核型急性髓細胞性白血病患者存在NF-κB基因的表達異常，NF-κB陽性者預后較差，是影響急性髓細胞性白血病患者預后的生物學指標之一。馬武開等［26］研究還報道了通過激活NF-κB的轉錄參與了白血病細胞的耐藥，通過抑制NF-κB的表達可降低白血病細胞的耐藥性，如新型抗腫瘤靶向治療藥物硼替佐米，通過抑制與κB解離，減少NF-κB的核轉位、抑制NF-κB的持續激活，產生促腫瘤細胞凋亡，從而增加細胞對放化療的敏感性。

綜上所述，NF-κB有可能成為CML急變期患者治療的新靶點。但是相關研究還要繼續深入，比如，慢粒急變期患者NF-κB的激活是否與AML患者相同，以及CML-BC期NF-κB的持續活化是否與Bcr-Abl癌基因相關，都值得繼續探討。

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Changes of the NF-κB in acute transformation phase of chronic myelogenous leukemia

Aikebaier·Abudureyimu1XU Li1Ayimunisa·Abudureheman1Hairesa·Abulimiti1LIU Jiajun2▲
1.Department of Hematology，the First People's Hospital of Kashgar District，Xinjiang Uygur Autonomous Region，Kashgar844000，China；2.Hematology Institute of Sun Yat-sen University，Guangdong Province，Guangzhou 510630，China

R733.7

A

1674-4721（2016）08（b）-0016-04

2016-05-05本文編輯：任念）

新疆維吾爾自治區科技廳少數民族科技人才特殊培養計劃科研項目（201323132）。

艾克拜爾·阿布都熱衣木（1974-），男，碩士，副主任醫師；研究方向：白血病。