兩種血管外膜成纖維細胞培養方法的比較與經驗總結

李　軍　羅麗敏　樊　勇　張勇剛　黨書毅　丁文惠.北京大學第一醫院心內科，北京　000；.湖北醫藥學院附屬太和醫院心內科，湖北十堰　00；.中國醫科大學第一附屬醫院皮膚科，遼寧沈陽　0；.北京大學第一醫院風濕免疫科，北京　000；.汕頭大學第二附屬醫院心內科，廣東汕頭　0

兩種血管外膜成纖維細胞培養方法的比較與經驗總結

李軍1，2羅麗敏3樊勇4張勇剛5黨書毅2丁文惠1
1.北京大學第一醫院心內科，北京100034；2.湖北醫藥學院附屬太和醫院心內科，湖北十堰442005；3.中國醫科大學第一附屬醫院皮膚科，遼寧沈陽110122；4.北京大學第一醫院風濕免疫科，北京100034；5.汕頭大學第二附屬醫院心內科，廣東汕頭515041

目的比較兩種血管外膜成纖維細胞（AFs）培養方法的差異并總結經驗。方法 獲取大鼠主動脈血管外膜組織，切成小塊，一部分采用組織貼塊法進行原代培養，另一部分使用消化酶消化獲取細胞，使用相差顯微鏡觀察細胞形態、免疫組化鑒定細胞內特定蛋白表達、細胞計數計算生長曲線等實驗手段，并比較兩種方法之間的差異。結果 貼塊法和消化法均能成功獲得AFs；經免疫組化檢測，兩種方法所獲的細胞波形蛋白（Vimentin）表達陽性/a-平滑肌肌動蛋白（a-SMA）表達陰性，證實培養的細胞為AFs。兩種方法獲得的細胞在細胞增殖期、對數生長期和平臺期的時間大致相同，二者的生長、增殖比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 貼塊法和消化法均能成功培養AFs，所獲得的細胞性狀穩定、存活率高，可在體外穩定地傳代培養，在血管重構研究領域具有應用價值。

血管外膜成纖維細胞；組織貼塊法；消化法；經驗總結

［Abstract］Objective To compare the differences of two methods in adventitial fibroblasts culture and summarize the experience.Methods Aortic vascular adventitia were separated from 6 specific pathogen free wistar rats，and cut into small pieces.Half of adventitial fibroblasts were isolated and cultured using tissue explants adherent method，others by digestion method.Phase contrast microscope was used to observe the cell morphology，immunohistochemistry was used to identify the expression of vimentin and a-smooth muscle actin，and cell counts to determine rate of cell growth and proliferation.The differences between two groups were compared.Results Massive adventitial fibroblasts were obtained successfully by both tissue explant adherent method and digestion method.All of them were confirmed to be Vimentin（+）/a-SMA（-）cells by immunohistochemistry，which represented adventitial fibroblasts.The rate of cell growth and proliferation were comparable between two groups and showed no statistically significant difference（P＞0.05）.Conclusion Adventitial fibroblasts can be obtained and cultured successfully both by tissue explants adherent method and digestion method.Stability and high survival rate of adventitial fibroblasts gained from both two methods make it valuable in the future study of vascular remodeling.

［Key words］Adventitial fibroblasts；Tissue explants adherent method；Digestion method；Experience summary

血管外膜在血管重構的發生、發展過程中起到了重要的作用，是多種心血管疾病發病的結構基礎，針對血管外膜的研究是當前心血管領域研究熱點之一［1-2］。AFs是血管外膜的主要組成部分，它在體內血管活性物質作用下，通過分泌活性因子，參與細胞表型轉化、增殖、凋亡、遷移及膠原的合成和分泌，從而參與血管的功能調節和修復過程［3-5］，AFs已成為治療心血管疾病的新靶點［6-8］。選擇合適的方法獲得AFs對于開展血管重構研究領域具有重要意義，本項目組在前期試驗中［9-11］，通過組織貼塊法和消化法均能在短期內獲得大量純度較高、生長狀態良好的AFs，現在對兩種方法進行比較并總結經驗。

1　材料與方法

1.1一般材料

4～6周齡（120～150 g，SPF級，屏障環境中飼養，普通飲食）健康雄性Sprague-Dawley大鼠由北京大學第一醫院實驗動物中心提供，許可證號：SYXK（京）2016-0001；DMEM/F12培養基、I型膠原酶和木瓜蛋白酶購自Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自Hyclone公司；免疫組化用小鼠抗大鼠α-SMA和Vimentin單克隆抗體購自武漢博士德公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的二抗購自碧云天公司，胰酶細胞消化液購自北京普利萊公司；超凈工作臺為Thermo公司產品（Heraguard ECO 1.5）、倒置相差顯微鏡為日本Olympus公司出品（BIO500-PH）、CO2培養箱為日本SANYO公司產品（MCO-18AC）、熒光顯微鏡為 Leica公司產品（AF6000）。

1.2大鼠AFs的原代培養

1.2.1大鼠血管外膜的獲取取雄性Sprague-Dawley大鼠，麻醉后斷頸處死，立刻浸泡于75%酒精中，5 min后轉移至無菌手術臺上，沿正中線剪開大鼠胸腔和腹腔，可見胸腹主動脈沿脊柱左側緣走形，剪取胸腹主動脈，浸泡于Hanks緩沖液中，無菌條件下轉移至超凈工作臺。先用含青鏈霉素的滅菌磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）沖洗血管內外殘留的血液，鈍性分離血管周圍的結締組織，然后用眼科剪將血管縱向剖開，使內膜面向上，用眼科彎鑷自上而下輕輕刮除內膜后，再小心撕下近內膜面的中膜平滑肌層，剩余的絮狀乳白色組織即為血管外膜［3，12-13］。

1.2.2貼塊法獲得Afs 將血管外膜組織用眼科剪剪成大小約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，均勻平鋪在25 cm2培養瓶的底部。輕輕翻轉培養瓶使瓶底面向上，向培養瓶中加入約6 mL含20%FBS的DMEM/ F12培養基，務必不要將組織塊沖掉。將培養瓶置入37℃、含5%CO2細胞培養箱中直立靜置2～4 h后，慢慢翻轉培養瓶，使培養液緩慢覆蓋組織塊，繼續培養約72 h后，可見AFs自組織塊周圍爬出。此時，不常規換液，僅向培養瓶中補加3 mL含 20%FBS的DMEM/F12培養基，既保證細胞生長所需的營養成分，又不會對培養液的PH值、溫度等造成大的影響。4～6 d后，待細胞生長達到70%～80%融合狀態時即可按1∶4傳代，取2～3代細胞進一步實驗［14］。

1.2.3消化法獲得Afs取血管外膜組織，剪成小塊后，加入 1 mL消化液（消化液配方［15-16］：I型膠原酶0.5%、木瓜蛋白酶0.05%、牛血清白蛋白0.2%、二硫蘇糖醇1 mmol/L，使用不含氯化鈣的Hanks平衡鹽溶液溶解），37℃水浴15～30 min，然后經200目不銹鋼濾網過濾消化液，加入2 mL培養液終止消化，1000 r/min離心2 min，棄掉上清液，加入5 mL含20%FBS的DMEM/F12培養基重懸，將細胞接種于60 mm的培養皿中，置于37℃、含5%CO2細胞培養箱中培養，24 h后換液。此后每隔48 h換液一次，直至消化傳代。

1.3AFs的鑒定

蓋玻片泡酸并高壓消毒滅菌后，置于培養皿中，將AFs懸液種植于培養皿，待細胞生長至50%融合狀態時，倒掉培養液，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定20min，用含0.3%Triton X-100、1%牛血清白蛋白的PBS透化處理，加封閉血清室溫封閉60 min后，倒掉封閉血清，加小鼠抗大鼠α-SMA抗體及Vimentin抗體，37℃孵育2 h，PBS沖洗3 min×3次。免疫熒光法：滴加FITC標記的山羊抗小鼠二抗，避光孵育60 min，倒置熒光顯微鏡下觀察結果，拍片。二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色法：滴加HRP標記的山羊抗小鼠二抗，室溫孵育60 min后，PBS沖洗3 min×3次，滴加DAB顯色液，在顯微鏡下觀察控制反應速速，1～5 min即可，自來水充分沖洗，蘇木素復染，鹽酸酒精溶液浸泡返藍，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結果，拍片。

1.4細胞生長曲線測定

分別將貼塊法和消化法兩種培養方法獲得的第2代AFs消化，細胞計數后，用含10%FBS的DMEM/ F12培養基調整細胞濃度為2×104個/mL，每孔1 mL接種于12孔培養板，放置培養箱內培養，每隔24 h收集每組3孔細胞并計數，取平均值，連續計數7 d后繪制生長曲線［17］。

1.5統計學方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，兩組之間均數的比較采用t檢驗，多組間比較用方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1AFs的原代培養

血管外膜組織塊在培養72 h后，可見少量成纖維細胞自組織塊邊緣爬出，漸向外生長形成細胞暈，進而形成細胞簇（圖1a）。剛長出的細胞呈圓形，后變為橢圓形，隨后細胞逐漸展開，伸出偽足，形態多樣，呈梭形、多角形、星形或不規則形，大小略有差異（圖1b）。細胞逐漸圍繞組織塊呈放射性生長，聚集成片（圖1c），傳代后80%～90%的細胞可重新貼壁生長，其生長方式及形態特點同前一致。消化法得到的細胞散在、成片分布，細胞形態和貼塊法一致（圖1d）。

2.2AFs的鑒定

取第2代AFs進行鑒定，待細胞長至50%融合狀態時，固定細胞，加入α-SMA及Vimentin一抗抗體孵育后，再滴加FITC/HRP標記的二抗，顯微鏡下觀察、拍片。可見α-SMA在細胞中基本沒有表達（圖2a、2c），而Vimentin在AFs中高表達（圖2b、2d），證實培養的細胞為典型的AFs。

圖1　原代培養的AFs形態圖

圖2　鑒定體外培養的AFs

2.3兩種方法獲得的細胞生長曲線比較

傳代后AFs懸浮于培養液中，在重力的作用下逐漸下沉至培養板底，散在分布于培養板中，初始形態為圓形，后逐漸變成紡錘形、梭型、不規則性，細胞逐漸增大，3～6 h即完全貼壁，細胞伸出偽足并相互交織成網，逐漸形成細胞單層，鋪滿瓶底。AFs的倍增時間較短，在一段時間內AFs數量與時間呈正相關，1～3 d為細胞增殖期、3～6 d為對數生長期、6～7 d為平臺期，與人皮膚成纖維細胞類似［17］。本項目中貼塊法和消化法所得細胞在細胞增殖期、對數生長期和平臺期的時間大致相同，二者的生長、增殖比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖3　第二代貼塊法和消化法培養的AFs生長曲線

3　討論

貼塊法是將組織剪成小塊，貼附在培養瓶上，加入培養液浸沒組織塊，讓細胞從組織塊中爬出的一種方法，其優點在于操作簡單、步驟少、成本低、影響因素少、細胞爬出時間固定，便于實驗者把控時間［3］；缺點在于部分組織細胞爬出慢、耗時長。消化法常采用膠原酶、胰酶、彈力酶、透明質酸酶及鏈霉蛋白酶等酶將組織消化分散，使細胞從組織中脫落出來。優點在于培養時間短，短期內可以獲得大量細胞；缺點在于操作復雜、不同組織消化時間長短不固定、不同種類的消化酶對細胞狀態影響較大、步驟繁瑣帶來污染概率增加，且消化酶昂貴，因而消化法的應用受到一定限制。本項目參考北京大學第一醫院風濕免疫科博士生高蘭、樊勇等人的經驗［15-16］，采用組合酶消化法，消化時間控制在0.5 h以內，可以短時間內獲得大量活細胞。一般而言，貼塊法從獲取組織到細胞傳代需要7～10 d，而消化法只需要5～6 d。細胞在傳代以后，兩種方法獲得AFs在增殖期、對數生長期和平臺期的時間大致相同，因而兩種培養方法在這一階段相比沒有差異。

AFs原代培養時難免混雜少量的其他細胞，包括平滑肌細胞、內皮細胞、脂肪細胞等，利用AFs生長速度快、數優的特點，在傳代培養過程中能排斥其他細胞而優先增殖，經過幾代的傳代生長后，能達到自然純化的效果，得到較高純度的AFs［18］。Vimentin是細胞骨架中間纖維家族成員，主要在成纖維細胞中表達；α-SMA主要表達于平滑肌細胞，所以可根據Vimentin表達陽性/a-SMA表達陰性來鑒定成纖維細胞。本項目中兩種方法培養的細胞，使用免疫組化方法鑒定，可見Vimentin表達陽性/a-SMA表達陰性，故而可以確定所培養的細胞為AFs。

原代培養第一次傳代時機的掌握非常重要，一般認為選取細胞接近或完全融合成片時進行傳代。貼塊法原代培養時由于組織塊的分布不均勻，且活性不一，導致細胞生長也不均勻，經常是一些區域已長成致密細胞層，一些區域仍未見細胞爬出，這種情況下，當整瓶細胞達亞融合時，致密細胞層已“老化”，功能狀態不佳。所以可根據細胞生長狀況在細胞未達80%融合時進行“原瓶”傳代，使細胞能均勻貼壁生長及避免局部細胞“老化”。在細胞傳代消化以細胞成片收縮、變圓變亮、細胞間隙增大時為宜，若消化過度、時間過長，易嚴重損傷細胞膜，細胞難以貼壁成活，影響后續實驗，經驗是胰酶定量、時間固定、操作迅速、動作輕柔、及時終止消化。

綜上所述，組織貼塊法和消化法均能成功培養AFs，兩種方法獲得的細胞性狀穩定、存活率高，為從細胞水平研究血管重構性疾病的發病機制提供了可靠的模型。

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Comparison and experience of two methods for the culture of adventitial fibroblasts

LI Jun1，2LUO Limin3FAN Yong4ZHANG Yonggang5DANG Shuyi2DING Wenhui1
1.Department of Cardiology，Peking University First Hospital，Beijing100034，China；2.Department of Cardiology，Taihe Hospital，Hubei University of Medicine，Hubei Province，Shigyan442005，China；3.Department of Dermatology，the First Affiliated Hospital of China Medical University，Liaoning Province，Shenyang110122，China；4.Department of Rheumatology and Clinical Immunology，Peking University First Hospital，Beijing100034，China；5.Department of Cardiology，the Second Affiliated Hospital，Shantou University Medical College，Guangdong Province，Shantou 515041，China

R322.1

A

1674-4721（2016）08（b）-0004-05

2016-04-20本文編輯：趙魯楓）

湖北省自然科學基金項目（2011CDC049）；太和醫院2014年國家級科研項目培育基金計劃（2014PY03）。

李軍（1981.9-），男，博士；研究方向：血管活性物質在血管穩態和重構中的作用機制。

丁文惠（1954.4-），女，教授，主任醫師，博士生導師；研究方向：血管重構與心衰。