基于PCR技術的木材腐朽菌鑒定方法的研究

馮　璐，戚大偉

(東北林業大學 理學院，哈爾濱 150040)

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基于PCR技術的木材腐朽菌鑒定方法的研究

馮璐，戚大偉*

(東北林業大學 理學院，哈爾濱 150040)

木材腐朽菌侵染木材而造成的木材腐朽現象會對木材的質量有著很大的影響，為了鑒定木材腐朽的病原菌，基于PCR技術設計了一種快速鑒定木材腐朽病原菌的方法。首先從腐朽木材上分離純化得到兩種病原菌，之后對兩種病原菌進行實驗室培養，通過觀察其培養特性對其進行形態學鑒定。隨后設計了7組引物，對兩種病原菌進行了PCR擴增，并通過BLAST對比鑒定出這兩種木材腐朽病原菌。研究結果表明，木材腐朽菌A為彩絨革蓋菌，木材腐朽菌B屬于多孔菌屬真菌。分子生物學鑒定結果與形態學鑒定結果一致，而基于PCR技術的的鑒定方法更為簡便快捷且精確，證明了該方法的可行性。

木材腐朽病原菌；PCR；引物設計；分子水平鑒定

0　引　言

木材在人類生產生活的各個方面有著非常重要的作用，但是隨著經濟的發展木材資源已經供不應求，保證木材的質量顯得尤為重要。在影響木材質量的眾多因素中，由木材腐朽菌侵染木材而引起的木材腐朽現象十分常見。木材腐朽發生頻率高并且影響范圍廣，對木材質量造成不可逆的破壞，每年由木材腐朽引起的木材資源流失數目龐大，對人們的生產和生活也帶來了嚴重的影響。為了合理使用木材資源，減小由木材腐朽菌造成的大面積木材腐朽，人們對木材腐朽和木材腐朽菌作了深入的研究[1]。目前鑒定木材腐朽菌的方法主要有兩種，一種是傳統的形態學鑒定方法，即通過觀察菌落宏觀培養特性和微觀培養特性的特征來對菌種進行鑒定和分類；另一種是近年來發展起來的分子水平的鑒定方法[2]，該方法依賴于PCR技術，通過擴增未知菌種的DNA序列，測序后與基因庫內已知菌種進行比對來鑒定木材腐朽菌。PCR在物種鑒定上的應用集中在醫學病原菌的鑒定、農副產品的鑒定上，而將PCR技術運用到木材腐朽的病原菌上的研究才剛剛開始[3-9]。

1　木材腐朽菌形態學鑒定

1.1木材腐朽菌的采集和篩選

菌種來源：菌種采集于東北林業大學林場，從人工水曲柳林病株上采集新鮮子實體，并在實驗室內進行培養。

用75%的酒精對新鮮的子實體進行消毒后在無菌環境下將其切割成0.2 cm3的組織塊，用70%酒精對組織塊表面進行消毒，之后放入0.1%升汞消毒液中浸泡2 min，立即用無菌水沖洗3次，然后用鑷子接種到PDA斜面培養基上，將斜面培養基放置于25℃生物培養箱中進行培養并每天觀察菌種的生長狀況，當菌絲布滿斜面時即完成菌種的分離[10-11]。經過分離獲得了A、B兩種木材腐朽菌。

1.2木材腐朽菌的生物學特性

1.2.1溫度

選取5種不同溫度對兩種真菌進行培養，分別為15、20、25、30、35℃[12]，每組設置5個重復，控制其他培養基成分相同(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121℃滅菌20 min)，之后將已接種的各組培養皿置于不同溫度的生物培養箱中自然光條件下進行培養，觀察并記錄A、B兩菌種的生長情況，記錄第7天時每組菌落的平均直徑。

1.2.2pH值

選取5種不同酸堿度的PDA培養基對兩種真菌進行培養，分別為pH 6、pH 6.5、pH 7、pH 7.5、pH自然(經測pH=6.8)[13]，每組設置5個重復，控制其他培養基成分相同(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min)，之后將已接種的各組培養皿放置于25℃生物培養箱中進行培養，觀察并記錄A、B兩木材腐朽菌菌種的生長情況，記錄第7天時每組菌落的平均直徑。

1.2.3光照強度

分別將生物培養箱的光照強度設置為0、1 000、2 000、3 000 lux[12]，每組設置5個重復，控制其他培養基成分相同(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL，溫度25℃，pH自然，121℃滅菌20 min)，之后將接種的培養基置于不同溫度的生物培養箱中自然光條件下進行培養，觀察并記錄A、B兩菌種的生長情況，記錄第7天時每組菌落的平均直徑。

1.3木材腐朽菌的形態學特性

1.3.1菌落特征

當菌絲生長至接近培養皿邊緣10 mm時打開培養皿上蓋[7]，將培養皿至于水平臺上，用普通數碼相機拍攝菌落此時的生長狀況。

1.3.2菌絲特征

制作菌絲體玻片，置于光學顯微鏡下進行觀察。

2　基于PCR技術的分子生物學鑒定

2.1PCR引物的設計

引物的優劣直接關系到PCR擴增的成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅萬象的規則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設計。用特異性引物擴增ITS區段這種方法允許所擴增ITS區段的測序結果存在一定的誤差，由于木材腐朽菌ITS區段的長度一般都在400bp以上，所以少量誤差并不會影響最終鑒定結果[14-17]。在對ITS區段的DNA序列進行分析時，即使DNA序列數據庫中沒有被鑒定菌株所屬物種的DNA序列，通過BLAST軟件搜索出的物種也應是數據庫中與被鑒定物種最近緣的物種，結合經典鑒定方法也可以對菌種做出正確的鑒定。

本文共設計了7對引物對供試材料的rDNA ITS序列進行PCR擴增。這7對引物分別是：Fung / ITS4，ITS1 / ITS4，NS1 / NS4，OPAA11 / OPAA18，OPD18 / OPD15，OPAA17 / OPO15，OPAA11 / OPD18。

各引物序列如下：

2.2反應條件的設計與優化

PCR反應體系(20 μl)如下：

注：不足20 μl的體積用dd H2O補足。每次反應均以無菌去離子水替代模板DNA作為空白對照[18]。

PCR擴增反應PCR儀上進行，反應時間大概兩小時，熱循環參數設定如下：

3　結果與分析

3.1形態學鑒定

3.1.1生物學特征

木材腐朽菌A的適宜生長溫度為20～25℃，最適生長溫度為25℃。15～25℃時，菌種的生長速率隨著溫度的升高而增高，25℃是達到最高，之后生長速率急速降低。木材腐朽菌B生長速率與木材腐朽菌A基本相同。不同溫度下兩種木材腐朽菌的生長速率如圖1和圖2所示。

圖1　不同溫度下菌落A的生長速率Fig.1 The growth rate of colony A under different temperature

圖2　不同溫度下菌落B的生長速率圖Fig.2 The growth rate of colony B under different temperature

兩種木材腐朽菌的最適生長pH值均為7左右，但由于PDA培養基自然狀態下(不用酸堿調節pH的情況下)pH約為6.8，此時兩菌種的生長速率和pH=7時的生長速率非常接近，為了方便操作、節省資源，可以選擇pH自然狀態下進行培養。不同溫度下兩種木材腐朽菌的生長速率如圖3和圖4所示。

圖3　不同pH下菌落A的生長速率Fig.3 The growth rate of colony A under different pH

圖4　不同pH下菌落B的生長速率Fig.4 The growth rate of colony B under different pH

兩種木材腐朽菌對光照不敏感，在不同的光照條件下生長速率基本相同，說明光照強度對兩種木材腐朽菌的生長基本沒有影響。

3.1.2形態學特征

對兩種木材腐朽菌進行實驗室培養，通過數碼照相機照相后結果如圖5和圖6所示。

圖5　木材腐朽菌A的菌落生長狀況Fig.5 The colony’s growth condition of wood-decaying fungi A

菌種A：生長速率快，1～2周覆蓋平板；菌落邊緣為鋸齒狀；菌絲體緊貼于瓊脂培養基表面生長；菌絲短而纖細，疏松地排列在培養基表面，形成一個絨毛狀菌落；菌落保持白色或奶油色；表面較平滑；在6周前反面部分變褐；生長新區的邊緣菌絲為升起的羊毛狀；培養皿對光觀察，不能分清單個菌絲的尖端。

圖6　木材腐朽菌B的菌落生長狀況Fig.6 The colony’s growth condition of wood-decaying fungi B

菌種B：生長速率快，2周覆蓋平板；菌落邊緣為鋸齒狀；菌絲體在培養基內部生長，在表面之下；菌絲緊密扭結，形成一個白色外皮殼，較硬且不易剝落；菌落保持白色；在6周前反面部分變褐；生長新區的邊緣菌絲平伏在培養基表面；培養皿對光觀察，能夠分清單個菌絲的尖端。

挑取兩種木材腐朽菌做成臨時裝片，分別置于光學顯微鏡下觀察，得到結果如圖7和圖8所示。

圖7　光學顯微鏡下木材腐朽菌A的菌絲照片Fig.7 The mycelium photos of wood-decaying fungi A under optical microscope

菌種A：生長新區的菌絲無色，節狀分隔；氣生菌絲像生長新區的菌絲，具有垂直分枝；纖維菌絲較多，壁厚，時常分枝，彎曲和交織在一起；分生節有孢子。

菌種B：生長新區的菌絲無色，多分枝，有內含物，節狀分隔很多，柔軟；氣生菌絲像生長新區的菌絲；纖維菌絲多，顏色深，分枝較明顯，中空或有內含物；擔孢子透明，均勻，圓柱形。

經過試驗觀察菌種A、B的宏觀和微觀特征，包括菌種的最適生長環境，菌落的顏色、質地、生長速率、邊緣特征，顯微鏡下各個階層菌絲的形狀、生長狀況等，可以大致判斷出兩種木材腐朽菌所屬的科屬情況。真菌A屬于擔子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、栓菌屬；木材腐朽菌B屬于擔子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、多孔菌屬。

3.2分子生物學鑒定

對兩種木材腐朽菌7對引物擴增后得到的DNA序列分別登陸GeneBank，在DNA序列數據庫中進行同源DNA序列的搜索工作，并進行BLAST對比，根據BLAST搜索和比較的結果，判斷菌絲體菌種的物種或與其近緣的物種[19-20]。

登錄GenBank，在GenBank核酸序列數據庫中進行BLAST序列相似性檢索，引物1擴增序列對比得到與菌種A相似率為96%的為Trametes versicolor(L.)Lloyd.彩絨革蓋菌，引物2擴增序列檢測到與被試樣品序列相似性為85%以上的菌種3種，引物3、5、6、7擴增產物并未在genebank上找到與其相似性達到50%以上的已知序列，引物4擴增序列檢測到與被試樣品相似率為83%以上的4種菌。而之前經典形態學鑒定方法對該菌種的子實體照片、菌落照片、菌絲照片的鑒定結果是木材腐朽菌A為采絨革蓋菌。

在GenBank核酸序列數據庫中進行BLAST序列相似性檢索，未檢測到木材腐朽菌B這個種，但與菌種B相似率在85%以上的同源物種序列共有9個，將這9個序列同測得的菌種B序列一起進行系統發育分析。從圖中可以看出，10個序列形成3個大的聚類組，木材腐朽菌B與多孔菌屬其他種同屬于一個聚類組，每個分支間的自舉支持率都很高(>87%)，序列差異小，親緣關系近。菌種B與另兩個聚類組的自舉支持率都很低(<50%)，序列差異大，說明其親緣關系遠。由此可以確定木材腐朽菌B屬于多孔菌屬真菌，如圖9所示。

圖9　用ITS序列構建的木材腐朽菌B系統發育樹Fig.9 Wood-decaying fungi B phylogenetic tree constructed of ITS sequence

4　結　論

本文用PCR方法快速鑒定了兩種木材腐朽菌，并結合傳統的形態學鑒定方法，通過對比分析兩種鑒定結果發現，兩種鑒定方法得到的結果一致。但對木材腐朽菌A進行鑒定時，分子水平的鑒定精確到了種的水平，而傳統形態學方法只能判定該菌種是臥孔菌屬，并不能判定它是哪種菌種。因此在基于PCR技術的木材腐朽菌快速鑒定方法更加精確。

然而，基于PCR技術的木材腐朽菌快速鑒定方法也存在一定的局限性，由于ITS序列的高度保守性，種間關系相近的種的ITS序列之間的差異非常微小，所以這種分子鑒定方法不適合于屬內種及種群間的鑒定[14-15]，只有把傳統形態學鑒定方法和基于PCR技術的鑒定方法想結合，才能得到更加可靠地鑒定結果。

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Study on Identification of Wood-decayingFungi Based on PCR Technique

Feng Lu，Qi Dawei*

(College of Science，Northeast Forestry University，Harbin 150040)

Wood decay caused by wood-decaying fungi will affect the wood quality.In order to investigate the pathogens resulted in wood decay，a new method was designed to rapidly identify wood-decaying fungi based on PCR(Polymerase chain reaction)technique.Two pathogens separated and depurated from decayed wood were cultivated in the laboratory，and then wood-decaying fungi was identified by morphological identification method.Seven groups of primer were designed to refine and amplify the PCR conditions.Two wood-decaying pathogens were compared and identified with BLAST.Results showed that wood-decaying fungi A wasTrametesversicolor(L.)Lloydwood-decaying fungi and fungi B belonged toPolyporaceaePolyporus.The results obtained by molecular identification were consistent with that by morphological identification.It is proven that the identification method based on molecular is feasible due to its rapid and accurate characteristics.

wood-decaying fungi；PCR；primer design；molecular identifications

2016-05-20

國家自然科學基金(31570712)

馮璐，碩士研究生。研究方向：生物物理。

戚大偉，博士，教授。研究方向:生物物理。

馮璐，戚大偉.基于PCR技術的木材腐朽菌鑒定方法的研究[J].森林工程，2016，32(5)：35-39.

S 782.3

A

1001-005X(2016)05-0035-05

E-mal：qidw9806@126.com