利用SSR分子標(biāo)記鑒定甜瓜雜交種純度

方小雪，姚少林，薄永明(寧波微萌種業(yè)有限公司,浙江寧波 315012)

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利用SSR分子標(biāo)記鑒定甜瓜雜交種純度

方小雪，姚少林，薄永明*
(寧波微萌種業(yè)有限公司,浙江寧波 315012)

摘 要：以2個(gè)甜瓜雜交種東之星、含香雪及其親本為材料,利用SSR標(biāo)記對(duì)2組雜交種進(jìn)行純度鑒定。從供試的72對(duì)SSR引物中篩選到親本間具有多態(tài)性的引物,東之星為3對(duì),含香雪為3對(duì),其中1對(duì)引物在2個(gè)雜交種的親本間均存在多態(tài)性。對(duì)2個(gè)雜交種東之星和含香雪分別用篩選出的3個(gè)多態(tài)性的SSR引物進(jìn)行甜瓜雜交種子純度鑒定,鑒定結(jié)果分別為99.2%和97.2%。

關(guān)鍵詞：甜瓜;純度鑒定;分子標(biāo)記; SSR標(biāo)記

DOI 10.16178/j.issn.0528-9017.20160209

甜瓜(Cucumis melo L.)是一種色、香、味俱佳的水果,深受消費(fèi)者喜愛(ài),是我國(guó)重要的傳統(tǒng)特色水果［1-2］。隨著甜瓜雜交種的廣泛推廣和種業(yè)市場(chǎng)的日趨成熟,甜瓜雜交種純度快速檢驗(yàn)的重要性越來(lái)越突出。傳統(tǒng)的雜交種純度檢測(cè)方法主要通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定,許多性狀表現(xiàn)受栽培措施及環(huán)境的影響,鑒定者的觀察經(jīng)驗(yàn)也影響著鑒定的準(zhǔn)確性。理想的鑒定技術(shù)不但要準(zhǔn)確可靠,還要簡(jiǎn)單快速經(jīng)濟(jì),這是品種鑒定實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的前提,也是品種鑒定技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。

分子標(biāo)記相對(duì)于傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記具有理論上標(biāo)記數(shù)目無(wú)限、不受環(huán)境因素的影響等優(yōu)點(diǎn),使它的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。本文以2個(gè)甜瓜雜交種東之星和含香雪的隨機(jī)樣本及其親本為材料,利用SSR標(biāo)記進(jìn)行甜瓜F1代種子純度鑒定,以期縮短純度鑒定周期。

1　材料與方法

1.1材料

以2個(gè)甜瓜雜交種東之星、含香雪及其親本為材料,由寧波微萌種業(yè)有限公司提供。

1.2方法

1.2.1播種與種植

東之星和含香雪及其親本2015年2月10日穴盤(pán)播種,2015年3月25日定植田間進(jìn)行田間純度鑒定。

1.2.2DNA提取

取同批供試材料的種子催芽,待到種根長(zhǎng)度達(dá)2 cm左右,將去除種皮和子葉的種根置于1.5 mL離心管中,CTAB法提取基因組DNA。

1.2.3PCR擴(kuò)增與快速檢測(cè)

72對(duì)甜瓜引物由嘉興美之奧種業(yè)有限公司提供。PCR MasterMix由北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司提供。所用PCR體系為20 μL,取DNA提取液2 μL (模板DNA濃度50 ng·μL-1),正反向引物各1 μL (引物濃度10 ng·μL-1),2×U Taq PCR MasterMix 10 μL,超純水6 μL。PCR反應(yīng)參數(shù):95℃下預(yù)變性5 min后,95℃變性30 s,55℃退火30 s (退火溫度依引物而異),72℃延伸45 s,共35個(gè)循環(huán),最后72℃下延伸10 min。用3%瓊脂糖凝膠檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1引物篩選

利用72對(duì)SSR引物對(duì)東之星和含香雪這2個(gè)雜交種的親本DNA進(jìn)行擴(kuò)增,以篩選在親本間具有多態(tài)性差異的引物。東之星引物篩選結(jié)果如圖1,melo3,melo5和melo17這3個(gè)引物擴(kuò)增的條帶在親本間有多態(tài)性,其他引物擴(kuò)增的條帶在親本間無(wú)多態(tài)性差異。含香雪引物篩選結(jié)果如圖2,melo5,melo38,melo48這3個(gè)引物擴(kuò)增的條帶在親本間有多態(tài)性,其他引物擴(kuò)增的條帶在親本間無(wú)多態(tài)性差異。

圖1　3對(duì)引物對(duì)東之星的擴(kuò)增結(jié)果

圖2　3對(duì)引物對(duì)含香雪的擴(kuò)增結(jié)果

在親本間篩選出有多態(tài)性的5對(duì)引物如表1所示,在東之星和含香雪的親本間分別篩選了3對(duì)具有多態(tài)性的引物,而且其中melo5引物在2個(gè)雜交種的親本間均檢測(cè)到多態(tài)性,說(shuō)明melo5對(duì)引物可同時(shí)鑒定東之星和含香雪這2個(gè)雜交種的種子純度。

表1　東之星和含香雪的親本間篩選的5對(duì)SSR引物

2.2SSR分子標(biāo)記純度鑒定

SSR引物在F1代呈共顯性,篩選出的在親本間具有多態(tài)性的引物擴(kuò)增出父母本互補(bǔ)的條帶。從篩選的具有多態(tài)性的引物對(duì)每個(gè)雜交種進(jìn)行種子純度鑒定。SSR引物melo3對(duì)東之星部分種子擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果如圖3所示,21粒真雜交種擴(kuò)增出父母本互補(bǔ)的2條譜帶,1粒假雜交種(箭頭所示)擴(kuò)增的譜帶與母本一致,這可能由于授粉前母本去雄不徹底等原因,造成母本自交結(jié)實(shí),使收獲的雜交種混有少量母本的種子。melo5和melo17純度鑒定結(jié)果分別如圖4和圖5,鑒定結(jié)果與melo3一致。隨機(jī)選取同批東之星250粒,用以上3對(duì)引物進(jìn)行純度鑒定,248份材料擴(kuò)增出父本和母本的條帶,2份材料只擴(kuò)增出母本條帶,說(shuō)明此248份雜交種為真雜種,2份材料為假雜種,東之星材料純度為99.2%。

SSR引物melo38對(duì)含香雪部分種子擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果如圖6所示,21粒真雜交種擴(kuò)增出父母本互補(bǔ)的2條譜帶,5粒假雜交種(箭頭所示)擴(kuò)增的譜帶與母本一致,這可能由于授粉前母本去雄不徹底等原因,造成母本自交結(jié)實(shí),使收獲的雜交種混有少量母本的種子。melo5和melo48純度鑒定結(jié)果分別如圖7和圖8,鑒定結(jié)果與melo3一致。選取同批次含香雪425粒,用以上3對(duì)引物進(jìn)行純度鑒定,413份材料擴(kuò)增出父本和母本的條帶,12份材料只擴(kuò)增出母本條帶,說(shuō)明此樣品中413份雜交種為真雜種,12份材料為假雜種,含香雪材料純度為97.1%。

圖3　melo3對(duì)東之星材料的擴(kuò)增結(jié)果

圖4　melo5對(duì)東之星材料的擴(kuò)增結(jié)果

圖5　melo17對(duì)東之星材料的擴(kuò)增結(jié)果

圖6　melo38對(duì)含香雪純度鑒定結(jié)果

圖7　melo5對(duì)含香雪純度鑒定結(jié)果

圖8　melo48對(duì)含香雪純度鑒定結(jié)果

2.3田間純度鑒定

東之星和含香雪分別田間定植300株,分別在苗期、結(jié)果期和成熟期進(jìn)行田間純度鑒定,東之星純度鑒定結(jié)果為99.8%,含香雪純度鑒定結(jié)果為98.4%。

3　討論

3.1SSR標(biāo)記鑒定與田間鑒定比較

本實(shí)驗(yàn)用SSR分子標(biāo)記純度鑒定結(jié)果為東之星種子純度為99.2%,含香雪種子純度為97.2%,田間純度鑒定結(jié)果為東之星種子純度為99.8%,含香雪種子純度為98.4%。SSR分子標(biāo)記純度鑒定結(jié)果與田間純度鑒定結(jié)果基本一致,但因SSR分子標(biāo)記是從DNA分子水平進(jìn)行標(biāo)記,因此比田間肉眼觀察更為嚴(yán)格,也更為準(zhǔn)確。但實(shí)際生產(chǎn)當(dāng)中,種子純度鑒定標(biāo)準(zhǔn)并不需要做到分子水平那么嚴(yán)格,因此如何將田間鑒定結(jié)果與SSR分子標(biāo)記結(jié)果統(tǒng)一,仍需要探索。

3.2SSR標(biāo)記在品種鑒定中的應(yīng)用

種子純度是種子質(zhì)量的重要指標(biāo),對(duì)作物產(chǎn)量及品質(zhì)有直接影響［3］。目前,種子純度鑒定的鑒定方法一般采取田間種植鑒定,不僅早期鑒定比較困難,還要耗費(fèi)大量人力物力,很難滿足生產(chǎn)中的需要。SSR標(biāo)記在DNA水平上對(duì)作物進(jìn)行標(biāo)記,可以在苗期進(jìn)行,不受環(huán)境的影響,穩(wěn)定性和重演性好,易于分析,已在多種作物上用于鑒定種子純度和品種真實(shí)性［4-8］。

本實(shí)驗(yàn)利用72對(duì)SSR引物對(duì)2個(gè)甜瓜雜交種的親本DNA進(jìn)行擴(kuò)增,在東之星和含香雪的親本間各篩選了3對(duì)具有多態(tài)性的引物,且引物melo5 在2個(gè)雜交種的親本間均檢測(cè)到多態(tài)性,說(shuō)明這些有多態(tài)性差異的SSR引物可有效用于這2個(gè)甜瓜雜交種純度的鑒定。本研究表明,SSR標(biāo)記多態(tài)性高,較易篩選到合適引物進(jìn)行種子純度鑒定,簡(jiǎn)單快速,可以將SSR技術(shù)進(jìn)行集成、規(guī)范和驗(yàn)證,應(yīng)用到甜瓜種子質(zhì)量的快速檢測(cè)工作中去。

3.3多引物組合鑒定

在生產(chǎn)實(shí)際中,種子純度不夠的主要原因是田間去雄不徹底,產(chǎn)生自交種子。然而,對(duì)于飛入了其他父本的異源花粉的F1種子則需選取擴(kuò)增條帶位置各不相同的SSR引物,將它們組合起來(lái)擴(kuò)增得到的特異分子標(biāo)記,不僅可以區(qū)分混入F1中的親本種子,而且可將混雜其中的其他品種的種子鑒別出來(lái),以進(jìn)一步提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度［9］。本實(shí)驗(yàn)中,東之星和含香雪分別篩選了3對(duì)具有多態(tài)性差異的引物,且分別用3對(duì)引物對(duì)雜交種進(jìn)行純度鑒定,確保了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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(責(zé)任編輯：張 韻)

通信作者:薄永明(1970—),男,浙江寧波人,高級(jí)農(nóng)藝師,從事蔬菜良種選育及推廣工作,E-mail:boyongming2@vip.sina.com。

作者簡(jiǎn)介:方小雪(1987—),女,河南安陽(yáng)人,碩士,從事蔬菜育種及生物技術(shù)研究工作,E-mail:961935710@qq.com。

收稿日期:2015-11-01

中圖分類(lèi)號(hào)：S652

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0528-9017(2016)02-0178-03

文獻(xiàn)著錄格式:方小雪,姚少林,薄永明.利用SSR分子標(biāo)記鑒定甜瓜雜交種純度［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,57 (2):178-181.