東莞地區串聯質譜技術篩查遺傳代謝病患兒的初步應用

袁晃堆　葉立新　姚月玲　方運勇　黃小玲　張玉瓊　肖燕青

[摘要]目的探討串聯質譜技術在東莞地區篩查先天性遺傳代謝病的應用價值，為先天性遺傳代謝病的臨床診斷提供實驗室依據。方法采用干血滴濾紙片法將患兒血液標本滴于采血紙片形成血斑，自然風干后應用APl3200串聯質譜儀進行檢測。結果在1206例遺傳代謝病高危兒的檢測中，篩查出高瓜氨酸血癥12例，Citrin缺陷病4例，丙酸血癥4例，戊二酸血癥2例，高精氨酸血癥3例，脂肪酸代謝異常6例（其中短鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥2例，中短鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥1例，極長鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥1例，肉堿棕櫚酰轉移酶一Ⅱ缺乏癥1例多種酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥1例），多種氨基酸代謝異常癥2例，尿素循環障礙癥2例，同型半胱氨酸尿癥1例，高甲硫胺酸血癥5例，苯丙酮尿癥5例，高苯丙氨酸血癥5例。結論串聯質譜技術具有高效快捷并可實現標準化自動化操作等優點，在先天性遺傳代謝病早期診斷方面有重要應用價值。

[關鍵詞]串聯質譜；遺傳代謝病；篩查；東莞地區

[中圖分類號]R722.1

[文獻標識碼]B

[文章編號]2095-0616（2016）03-167-04

遺傳代謝病，又稱先天性代謝異常（inbornerrors of metabolism，IEM），是指由于基因突變引起機體各類的缺陷或功能異常，使機體生化代謝發生改變，從而出現一系列相對應的機體生理變化和臨床癥狀。近年來，隨著人民生活水平的提高和醫

[基金項目]廣東省東莞市科技計劃項目（2012105150130266）。學科技的日益發展，很多非遺傳因素造成的疾病得到了控制，而遺傳因素在疾病構成中則日益突出。因此，解決先天性遺傳代謝病高危患兒的問題不容忽視。傳統的IEM檢測方法（如Guthrie細菌抑制法、放射免疫分析法、酶聯免疫吸附試驗等）都屬于“一種試驗檢測一種疾病”。自1990年Millington等首次將串聯質譜技術應用于新生兒遺傳病篩查以來，經過20多年的發展，串聯質譜已經發展成為IEM篩查診斷中最理想的朝陽技術。利用高靈敏性、高特異性和快速檢測的串聯質譜技術，能在2min內通過同時測定同一生物樣品中多種目標代謝物，實現一次實驗即可檢測出包括因氨基酸、有機酸代謝紊亂、脂肪酸氧化缺陷而導致的數十種遺傳代謝性疾病。將串聯質譜技術應用于遺傳代謝病的篩查，有助于IEM的早期診斷和治療。本研究應用串聯質譜技術對東莞市2011年9月～2014年12月的1206例IEM高危患兒進行了篩查，現報道如下。

1.資料與方法

1.1一般資料

2011年9月～2014年12月來東莞市婦幼保健院進行IEM檢查的疑似患兒共1206例，其中男829例，女377例，年齡為1d～12歲，中位年齡2.5歲。疑似IEM患兒具體表現為早產兒黃疸、心功能不全、腦功能障礙、肝內膽汁淤積、反復嘔吐、高乳酸、低血糖、智障、腦癱及器官功能損傷等。

1.2研究方法

1.2.1標本采集標本采集采用干血滴濾紙片法，采血部位可以是指端、足跟及耳垂。具體方法為：將患兒血標本滴于采血紙片形成一個或數個均勻血斑，自然風干后上機檢測。

1.2.2標本保存標本如不能及時檢測應密封_于20°C冰箱中待檢。

1.2.3儀器

采用美國生物應用系統公司（Applied Biosysterms）的APl3200串聯質譜儀。

1.2.4試劑、材料鹽酸正丁醇（3mol/L）由正丁醇和乙酰氯按9：1配制。氮氣純度為99.999%。96孔聚丙烯板，96孔過濾板（濾膜孔徑0.45um）。甲醇、正丁醇、乙酰氯、乙腈等純度均為高效液相色譜級。以上試劑及材料均購自德國Merck Millipore公司。

1.3測足方法

1.3.1樣品處理采用足跟或指端采血，滴于濾紙使之形成直徑>lcm的血斑，用打孔器將血斑制成直徑3mm的圓形濾紙血片，置于96孔過濾板中，每孔加入100uL含氨基酸和酰基肉堿同位素內標液的甲醇，室溫放置20min，然后離心至另一個96孔聚丙烯板，50°C加熱吹干，再加入60uL鹽酸正丁醇（3mol/L），Teflon膜覆蓋，置65℃恒溫箱內15min，隨后50℃加熱吹干，再加入80%乙腈100uL溶解，鋁膜覆蓋，即可上樣檢測。

1.3.2資料分析數據分析采用美國生物應用系統公司分析軟件Chemo View 2.0。根據已知濃度的同位素內標和各種丁酯化的氨基酸和酰基肉堿的離子峰強度，儀器可自動計算出所測樣品中氨基酸和酰基肉堿的濃度，然后進行臨床分析。

1.3.3質量控制

凡是第一次檢鋇IEM得兒童顯示陽性異常，排除了人工誤差和實驗室誤差之后，再用原血片重新檢測一遍，如果2次IEM篩查的結果都超出了參考值范圍，那該標本的IEM檢測結果為陽性。本院新生兒疾病篩查中心參加了美國疾病控制中心專項質量保證和定期進行實驗室間的實驗比對。串聯質譜儀操作人員、數據分析人員及診療人員曾多次到廣州婦女兒童醫療中心進行專項培訓進修，保證了串聯質譜結果的準確性，保證了IEM疾病診斷分析的可信性，治療的規范性。

2.結果

2.1檢測陽性病例

檢測疑似遺傳代謝病高危患兒血片1206份，診斷遺傳代謝病12種51例，檢出率為4.23%。篩查出的遺傳代謝病依次為：A，高瓜氨酸血癥12例；B.Citrin缺陷病4例；c.丙酸血癥4例；D.戊二酸血癥2例；E.高精氨酸血癥3例；F.脂肪酸代謝異常6例（其中已知濃度，中短鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥1例，極長鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥1例，多種酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥1例，肉堿棕櫚酰轉移酶-II缺乏癥1例）；G.多種氨基酸代謝異常2例；H.尿素循環障礙2例；I.同型半胱氨酸尿癥1例；J.高甲硫胺酸血癥5例；K.苯丙酮尿癥5例；L高苯丙氨酸血癥5例。

2.2臨床資料及臨床表現

2.2.1發病年齡51例陽性病例中新生兒時期發病21例（41.18%），1～12月發病18例（35.29%），2～4歲發病8例（15.69%），>4歲發病4例（7.84%）。

2.2.2臨床表現29例患兒腦功能障礙；14例早產兒黃疸、抽搐、昏迷；41例患兒喂養困難，出現反復嘔吐或慢性遷延性腹瀉的情況；5例患兒心力衰竭或心跳驟停（2例有易驚癥狀）；31例患兒肝脾腫大或肝硬變；26例患兒分別皮膚粗糙、干裂、脫皮且久治不愈以及伴有聽力障礙或視神經萎縮、唇裂等器官發育畸形。見表1。3討論

IEM的早期診斷對國民的健康保障重視程度息息相關，是衡量一個國家醫學發展水平的重要指標。國家政府目前已將“提高出生人口素質、減少出生缺陷、優生促進工程”作為近期的人口國策。國內由于社會經濟水平和醫療水平的制約，串聯質譜的技術與國外相比還不是非常完善和成熟。但是近年國內很多發達地區已陸續開展了串聯質譜技術應用于IEM的實驗診斷，使我們的技術愈加成熟與完善，串聯質譜檢測已經成為篩查和診斷IEM的常規手段。

本文研究結果顯示，東莞地區IEM檢出率是4.23%（51/120 6），在病種分類中主要以氨基酸代謝異常及脂肪酸代謝異常為主，臨床癥狀包括喂養困難、腦功能障礙、黃疸、心功能不全及相關畸形等。本研究就陽性率及病種分類均與鄰近的惠州鐘婉秀報道的4.07%（11/270）及主要病種為氨基酸代謝異常的結果接近，可能的原因是東莞市與惠州市外來人口眾多，分別占總人口數量的77%及27%，人群比較混雜，所以發病率與其他地區也有所差別。本研究存在的問題是陽性病例偏少，且未能對所檢測的患兒進行縱向的追蹤觀察。目前國內各地如廣東廣州、陜西西安、廣西南寧、山東濰坊及福建泉州等地區報道的結果顯示其檢出率相差甚遠，陽性率從1.0%～10.3%，而其病種構成比例則比較相近，以氨基酸及脂肪酸代謝異常為主，但臨床癥狀表現復雜，且與其病種構成并無直接聯系。綜上IEM檢出率相差甚遠顯示出其發病率有很強的地域性，是否因地區、民族不同造成檢出率的差異尚需進一步研究。由于各地報道的結果中存在所檢測的樣本數及樣本篩選標準不盡相同，普遍存在檢測標本量及檢出的病例過少的問題，造成各地區統計的陽性率可比性不高，這也是各地相關醫療工作者在統計實驗數據時應該關注的實際問題。

目前國內不少地區已在逐步開展串聯質譜技術在IEM中的應用，隨著串聯質譜技術不斷成熟及經濟實力不斷發展，相信IEM的治療會全面普及和標準化，讓IEM患兒得到早期診斷和及時治療，從而避免或減輕疾病的危害。