J亞群禽白血病病毒受體基因NHE1的遺傳多態性分析

陳偉國，李廣偉，嚴專強，謝青梅（. 華南農業大學動物科學學院，廣東 廣州 5064；. 廣東溫氏食品集團股份有限公司，廣東 云浮 57400）

J亞群禽白血病病毒受體基因NHE1的遺傳多態性分析

陳偉國1，李廣偉2，嚴專強2，謝青梅1
（1. 華南農業大學動物科學學院，廣東 廣州 510642；2. 廣東溫氏食品集團股份有限公司，廣東 云浮 527400）

為發掘J亞群禽白血病病毒（ALV-J）受體基因NHE1潛在的遺傳抗性位點，采用PCR技術分段擴增NHE1受體基因序列，并分析其遺傳多態性。結果顯示，在黃羽肉雞NHE1基因外顯子區域發現了16個SNP突變，分別為c.309 G＞C，c.11653 C＞T，c.11689 G＞A，c.11917 C＞T，c.11946 C＞T，c.13405 C＞A，c.13429 T＞C，c.13438 T＞C，c.14108 A＞C，c.14516 A＞G，c.14522 G＞A，c.14654 C＞T，c.15834 G＞A，c.15873 G＞A，c.17560 C＞G and c.17770 G＞A。進一步分析表明這些SNP突變均為同義cSNP，未引起氨基酸發生改變；在黃羽肉雞NHE1基因內含子區域發現了SNP和插入/缺失突變，NHE1基因內含子2 c.12239～12240 和c.13114～13115分別存在AGGGCTGC和TGAAGCC插入突變，內含子11 c.17073～17091存在TGTCCTGTGTCCTCCCTGC缺失突變；在ALV-J攻毒后陰性雞和陽性雞的NHE1基因外顯子區域均發現c.309 G＞C、c.11653 C＞T、c.13405 C＞A、c.13438 T＞C、c.14108 A＞C和c.14516 A＞G 6個SNP突變，內含子區域也均發現與黃羽肉雞相同的插入/缺失突變。研究結果表明，發現的NHE1受體基因遺傳變異位點不能作為ALV-J潛在的遺傳抗性位點。

J亞群禽白血病病毒；NHE1受體基因；序列分析；遺傳多態性

陳偉國，李廣偉，嚴專強，等. J亞群禽白血病病毒受體基因NHE1的遺傳多態性分析［J］.廣東農業科學，2016，43（7）：145-150.

J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒（ALV-J）引起的一種免疫抑制性腫瘤性傳染病［1］。ALV-J可引起感染雞群產生免疫抑制、生產性能下降，乃至發生血管瘤、骨髓瘤等特征性腫瘤而死亡，給養雞業造成巨大的經濟損失［2-3］。迄今為止，該病尚無商品化疫苗和有效的治療方法，主要通過凈化種群和生物安全措施進行預防［4］。近年來，已從商業肉雞、蛋雞品系和地方雞種中分離出ALV-J［5-7］。可見，現有措施并不能完全控制J亞群禽白血病在中國普遍發生與流行，該病已成為威脅我國養雞業（尤其是種雞業）可持續健康發展的重大疾病之一。因此，研發更適合防控ALV-J的新策略已迫在眉睫。近年有研究表明，抗病育種可以成為防控禽白血病的有效策略［8］。

禽白血病病毒（ALV）必須通過特異性受體侵入宿主細胞，不同亞群的ALV 由相應的細胞表面特異性受體介導侵入宿主細胞，繼而發生感染［9］。Chai等［10］證實ALV-J 侵入宿主細胞的受體是1型鈉氫交換蛋白（NHE1）。受體基因的遺傳變異會引起宿主對ALV的感染產生遺傳抗性。Kucerová等［11］報道了ALV-J的NHE1受體蛋白第38位氨基酸（色氨酸）的缺失，導致ALV-J宿主細胞對ALV-J的感染產生遺傳抗性。然而，關于中國雞種ALV-J受體基因NHE1是否存在潛在的遺傳抗性位點仍有許多未知。本研究擬通過分析ALV-J受體基因NHE1的遺傳多態性，以期發掘ALV-J受體基因NHE1潛在的遺傳抗性位點，為進一步研究宿主遺傳抗ALV-J的感染提供科學依據。

1　材料與方法

1.1試驗材料

惠陽胡須雞和杏花雞的DNA樣品保存于廣東省畜禽健康養殖與環境控制（企業）重點實驗室。快大黃雞、矮腳黃雞、青腳麻雞、208、411和603商業肉雞品系的血液樣品采自廣東溫氏食品集團祖代種雞場，每個雞種10個樣品。ALV-J攻毒后陰性雞和陽性雞培育于廣東省畜禽健康養殖與環境控制（企業）重點實驗室［12-13］。ALV-J攻毒后陰性雞和陽性雞樣品分別為12、18個。血液樣品的DNA提取按照血液DNA抽提試劑盒說明書進行，抽提的DNA 于-20℃下保存。

主要試劑：Premix PrimeSTAR HS和DL2000 DNA Marker購自大連寶生物公司，血液DNA抽提試劑盒購自天根生化科技有限公司，其他試劑為本實驗室自配。

1.2試驗方法

1.2.1引物設計及合成 根據GenBank 已收錄的原雞 N H E 1 基因序列（登錄號：NC_006110.4）設計7對引物用于PCR擴增ALV-J受體基因NHE1，擴增引物信息見表1，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。由于NHE1受體基因內含子1過長，共11 340 bp，涵蓋了c.329～11567，故不對其進行PCR擴增。

1.2.2NHE1基因的PCR擴增 NHE1基因7個片段的PCR擴增體系為25 μL：Premix PrimeSTAR HS 12.5 μL，DNA模板1 μL，F/R引物（10 μmol/L）各0.5 μL，雙蒸水補至25 μL。PCR反應程序為：95℃預變性3 min；94℃變性30 s、55～60℃退火45 s、72℃延伸1～1.5 min，共35個循環；72℃延伸10 min，12℃終止。將PCR擴增產物送美吉生物科技公司進行測序。

1.2.3NHE1基因的序列分析 運用DNAStar Lasergene 7.1軟件對不同黃羽肉雞品種（系）NHE1基因的測序結果進行拼接，并與GenBank登陸的原雞NHE1基因序列進行比對，分析不同黃羽肉雞品種（系）NHE1基因的遺傳多態性，以及對ALV-J攻毒后陰性雞和陽性雞NHE1基因的序列進行分析。

表1 NHE1基因PCR擴增引物信息

2 結果與分析

2.1黃羽肉雞NHE1基因的PCR擴增

利用PCR方法擴增出了NHE1 基因序列的7個目的片段，通過瓊脂糖凝膠電泳（圖1）可見，PCR擴增條帶大小與預期擴增片段大小一致。

圖1 NHE1基因7個片段的PCR擴增結果

2.2黃羽肉雞NHE1基因的序列分析

將NHE1基因PCR擴增產物送測序公司進行測序，對7個片段的測序結果運用DNAStar Lasergene 7.1進行拼接，獲得NHE1基因全長序列（內含子1除外）。將其與GenBank收錄的原雞NHE1基因序列（登錄號：NC_006110.4）進行比對分析，發現在外顯子區域存在16個SNP突變，分別為c.309 G＞C、c.11653 C＞T、c.11689 G＞A、c.11917 C＞T、c.11946 C＞T、c.13405 C＞A、c.13429 T＞C、c.13438 T＞C、c.14108 A＞C、c.14516 A＞G、c.14522 G＞A、c.14654 C＞T、c.15834 G＞A、c.15873 G＞A、c.17560 C＞G和c.17770 G＞A，這些SNP變異位點分別位于外顯子1、2、3、4、5、8、12等6個外顯子區域，且不同雞種發生的SNP突變位點的數量、位置及其頻率均存在差異（表2）。進一步分析發現，這16個SNP突變均為同義cSNP，未引起氨基酸發生改變，其在NHE1 基因mRNA序列（GenBank登錄號：NM_001044643.1）分別位于第309、414、450、678、708、888、912、921、1233、1311、1317、1449、1686、1725、2130和2340位核苷酸（表3）。

在黃羽肉雞的NHE1基因內含子區域發現插入/缺失突變，內含子2 c.12239～12240 和c.13114～13115分別發生AGGGCTGC 和TGAAGCC序列插入突變，內含子11 c.17073～17091發生TGTCCTGTGTCCTCCCTGC序列缺失突變，不同雞種NHE1基因內含子區域的遺傳變異情況見表4。另外，NHE1基因內含子區域發現多個SNP突變（未列出）。

表2 黃羽肉雞NHE1基因外顯子區域的遺傳多態性

表3 黃羽肉雞NHE1基因外顯子區域SNP突變信息

表4 黃羽肉雞NHE1基因內含子區域的遺傳多態性

2.3ALV-J攻毒后陰性雞和陽性雞NHE1基因的序列分析

ALV-J攻毒后的陰性雞NHE1基因序列與原雞相比，發現在外顯子區域存在6個SNP突變，其在第309、11653、13405、13438、14108和14516位核苷酸發生G→C、C→T、C→A、T→C、A→C和A→G改變，在內含子區域發現插入/缺失突變，內含子2 c.12239～12240 和c.13114～13115分別發生AGGGCTGC和TGAAGCC插入突變，內含子11 c.17073～17091發生TGTCCTGTGTCCTCCCTGC序列缺失突變；而在ALV-J攻毒后陽性雞NHE1基因中，發現與ALV-J攻毒后陰性雞存在相同的遺傳突變（表5）。

3　討論

NHE1是一種跨膜蛋白，涉及細胞轉運、增殖與凋亡等多種功能，與多腫瘤性疾病有密切關系［14］，是ALV-J的受體蛋白［10］。蔡黎明等［15］研究表明，NHE1蛋白在ALV-J感染引起的致病、致腫瘤過程中也發揮著重要作用。

表5 ALV-J攻毒后陰性雞和陽性雞NHE1基因的遺傳多態性

ALV-J用NHE1受體基因編碼的受體蛋白介導侵入宿主細胞，繼而發生感染。近年來有研究表明，受體基因的遺傳突變會導致宿主對ALV的感染產生完全抗性或易感性降低。Kucerová等［9］報道了ALV-J的NHE1受體蛋白第38位氨基酸的缺失，引起宿主對ALV-J的感染產生遺傳抗性。Reini?ová等［16］報道白來航品系M的tvb受體基因外顯子4發生SNP突變，導致TVB受體蛋白第125位氨基酸由半胱氨酸置換位絲氨酸，引起白來航品系M對ALV-B/D感染的易感性降低，對ALV-E的感染產生完全抗性。本研究在黃羽肉雞ALV-J受體基因NHE1外顯子區域發現了16個SNP突變，但這些SNP突變均為同義cSNP，未引起氨基酸發生改變。而在ALV-J攻毒后陰性雞和陽性雞均發現其中的6個SNP突變，提示這些NHE1受體基因SNP突變不能作為作為ALV-J潛在的遺傳抗性位點。筆者前期研究發現，中國雞種ALV-A受體基因tva內含子1破裂點信號保守區域c.502～511和c.502～516分別發生CGCTCACCCC和CGCTCACCCCGCCCC序列缺失突變，導致內含子1保留于tva受體基因mRNA中，并產生一個提前終止密碼子，干擾了tva受體基因mRNA的剪切，從而降低了宿主對ALV-A感染的易感性［17］。本研究發現，黃羽肉雞ALV-J受體基因NHE1內含子2 c.12239～12240和c.13114～13115分別發生AGGGCTGC和TGAAGCC序列插入突變，內含子11 c.17073～17091發生TGTCCTGTGTCCTCCCTGC序列缺失突變，然而，在ALV-J攻毒后陰性雞和陽性雞的NHE1受體基因也均發現存在上述的插入/缺失突變，提示發現的NHE1受體基因插入/缺失突變不能進一步作為ALV-J潛在的遺傳抗性位點去進行功能驗證。綜上所述，本研究在ALV-J受體基因NHE1外顯子區域發現的SNP突變及內含子區域發現的插入/缺失突變不能直接作為ALV-J潛在的遺傳抗性位點。

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（責任編輯 崔建勛）

Analysis on genetic polymorphism of avian leukosis virus subgroup J receptor gene NHE1

CHEN Wei-guo1，LI Guang-wei2，YAN Zhuan-qiang2，XIE Qing-mei1
（1. College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2. Guangdong Wen’s Food Group Co.，Ltd.，Yunfu 527400，China）

To explore the potential genetic resistance loci in avian leukemia virus subgroup J （ALV-J） receptor gene NHE1，the sequence of NHE1 receptor gene was amplified by PCR technique，and the genetic polymorphism of NHE1 gene was analyzed. The results indicated that 16 SNP mutations，including c.309 G＞C，c.11653 C＞T，c.11689 G＞A，c.11917 C＞T，c.11946 C＞T，c.13405 C＞A，c.13429 T＞C，c.13438 T＞C，c.14108 A＞C，c.14516 A＞G，c.14522 G＞A，c.14654 C＞T，c.15834 G＞A，c.15873 G＞A，c.17560 C＞G and c.17770 G＞A，were found within the exon region of NHE1 gene in yellow broilers，these SNPs were synonymous with cSNP and the changes of amino acid were not caused by further analysis. In addition，SNPs and insertion/deletion mutations were also found within the intron region of NHE1 gene in yellow broilers，the AGGGCTGC was inserted between c.12239 and 12240 and the TGAAGCC was inserted between c.13114 and 13115 within the intron 2 of NHE1 gene，respectively，and theTGTCCTGTGTCCTCCCTGC among c.17073-17091 was deleted in intron 11 of NHE1 gene. Furthermore，6 SNPs c.309 G＞C，c.11653 C＞T，c.13405 C＞A，c.13438 T＞C，c.14108 A＞C and c.14516 A＞G within the exon region，as well as insertion/deletion mutations within the intron region that were same with yellow broilers，were found in NHE1 gene of the negative and positive chickens after inoculated by ALV-J. The results demonstrated that the genetic mutation loci found in receptor gene NHE1 may not be used as potential genetic resistance loci of ALV-J.

ALV-J；NHE1 receptor gene；sequence analysis；genetic polymorphism

S858.317.4；Q346+.5

A

1004-874X（2016）07-0145-06

2016-04-12

廣東省自然科學基金團隊項目（S2013030013313）

陳偉國（1981-），男，碩士，助理研究員，E-mail：wgchen81@scau.edu.cn

謝青梅（1972-），女，博士，教授，E-mail：qmx@scau.edu.cn