桑葉γ-氨基丁酸提取工藝的響應面優化

鐘楊生，陳恒文，林碧敏，林健榮，陳芳艷（.華南農業大學動物科學學院，廣東 廣州 5064；.華南農業大學公共基礎課實驗教學中心，廣東 廣州 5064）

桑葉γ-氨基丁酸提取工藝的響應面優化

鐘楊生1，陳恒文1，林碧敏2，林健榮1，陳芳艷1
（1.華南農業大學動物科學學院，廣東 廣州 510642；
2.華南農業大學公共基礎課實驗教學中心，廣東 廣州 510642）

利用逐因子試驗和 Box-Behnken試驗，以水為溶劑對桑葉γ-氨基丁酸（GABA）的萃取工藝進行了條件優化研究。結果表明，最佳提取條件為，桑葉粉∶水=1（g）∶30（mL），提取溫度50℃，提取時間2.13 h，此工藝條件下提取率為0.464%，其中影響因素貢獻率為提取時間＞料液比＞提取溫度。

桑葉；γ-氨基丁酸；提?。籅ox-Behnken試驗

鐘楊生，陳恒文，林碧敏，等. 桑葉γ-氨基丁酸提取工藝的響應面優化［J］.廣東農業科學，2016，43（7）：120-125.

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，簡稱GABA）是一種具有重要生理功能的活性物質，在動物中有降血壓、抗驚厥、促使精神安定、促進腦部血流、增進腦活力、營養神經細胞、促進生長激素分泌、健肝利腎的作用，是哺乳動物神經中樞的一種抑制性遞質［1-5］。GABA在植物的抗逆中也發揮著積極的生理活性作用［6-8］。由于具有多種特殊的功能，GABA越來越引起醫藥、食品、化工、農業等行業的關注，成為開發研究的熱點。

經研究，發現作為藥食同源的桑葉富含GABA，尤其在桑嫩芽中含量高［9-11］。桑樹在我國種植廣泛，而且具有易種植、生產成本低、全年生長時間長、產量高的資源優勢，利用桑葉挖掘、發展新的GABA生物新材料，開發GABA功能食品和保健品，對拓展我國桑葉在非絹絲產業上的新用途是一種創新性的研究。響應面分析（Response Surface Methodology，RSM）廣泛應用于提取方法的優化。作為響應面分析方法之一，Box-Behnken Design （BBD）是一種不包含嵌入因子或部分因子的獨立二次設計［12］。由于可以建立二次響應面，BBD方法比其他響應面設計容易安排和解釋實驗，并且效率更高［13］，已成功應用于從天然材料中提取多酚類物質的條件優化［14］。本試驗應用響應面優化法研究桑葉GABA的提取工藝條件，為后續功能食品和保健品的開發提供技術和工藝參數。

1　材料與方法

1.1試驗材料

抗青10號桑葉，由華南農業大學動物科學學院提供，60℃干燥粉碎后置于4℃條件下冷藏備用。

γ-氨基丁酸，美國Sigma公司；無水甲醇、次氯酸鈉、重蒸酚、氫氧化鉀、無水乙醇、三氯化鑭、三氯化鋁、醋酸鉛、鹽酸、NaOH、正丁醇、醋酸、丙酮、鹽酸、氨水等均為國產分析純試劑。

1.2試驗方法

1.2.1GABA含量的測定 參照冀憲領改進的Berthelot法［9］測定GABA含量。稱取0.1000 g GABA標準品用蒸餾水定容至100 mL，標樣濃度為1 mg/mL。分別取待用標樣0、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mL于2 mL離心管中，加蒸餾水至1 mL，然后加入120 μL的1 mol/L LaCl3溶液，震蕩混勻15 min，12 000 r/min離心5 min；取上清500 μL于1.5 mL離心管中，加入300 μL 的1 mol/L KOH溶液，震蕩混勻5 min，12 000 r/min離心5 min；取上清600 μL置于15 mL具塞試管中，分別依次加入400 μL碳酸鹽緩沖液（pH值為10）、200 μL 60%重蒸酚溶液、1 mL 7.5%NaClO溶液，充分混勻，旋緊管塞，置于100℃水浴中恒溫反應10 min后置冰浴中10 min；分別向各試管中加入4 mL 60%乙醇溶液，在645 nm波長下測定吸光值。根據標準曲線得到回歸方程y=0.6827x+0.0249（R2=0.9923），表明GABA濃度與吸光度具有良好的線性。取適量樣品溶液測定吸光度，通過標準曲線計算樣品每克干桑葉中GABA的含量。

1.2.2桑葉GABA水提取法的單因素試驗 桑葉粉的預處理：取桑葉粉，用甲醇脫色、50℃干燥后備用。

（1）提取溫度對桑葉GABA提取率的影響。分別取2 g經預處理的桑葉粉6份，按料液比1（g）∶20（ mL）加水，在溫度為20、30、40、50、60、70℃的條件下提取2 h，提取1次，然后測定提取液中GABA的含量。

（2）不同料液比對桑葉GABA提取率的影響。分別取2 g經預處理的桑葉粉6份，按料液比（g∶ mL）：1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60加入蒸餾水，在50℃的條件下提取2 h，提取1次，然后過濾，測定提取液中GABA的含量。

（3）提取時間對桑葉GABA提取率的影響。分別取2 g經預處理的桑葉粉6份，按料液比1（g）∶20（ mL）加水，在50℃條件下分別提取1 、2 、3 、4 、5 、6 h，提取1次，然后測定提取液中GABA的含量。

（4）提取次數對桑葉GABA提取率的影響。分別取2 g經預處理的桑葉粉3份，按料液比1（g）∶20（ mL）加水，在50℃條件下分別提取1、2、3次，每次2 h，然后測定提取液中GABA的含量。

1.2.3BBD法組合優化提取條件 在以上單因素試驗的基礎上，選取適當的因素水平，根據表1進行BBD法組合優化，優選出提取桑葉GABA的最適條件和方法。

表1 傳統水提取法Box-Behnken試驗因素水平

采用Design-Expert V8. 0. 6 軟件對試驗數據進行分析處理。

2　結果與分析

2.1桑葉GABA提取的單因素試驗

2.1.1最適溫度 在20～70℃不同溫度條件下抽提桑葉GABA，結果見圖1。由圖1可知，在20～50℃之間抽提2 h， GABA的得率隨著溫度的升高而增加，50℃以后反而略有減少，其原因可能是溫度過高使GABA發生降解。因此50℃為最佳提取溫度。

圖1 溫度對GABA提取效果的影響

2.1.2料液比 在確立50℃為最佳提取溫度后，進一步優選最佳的料液比關系，結果見圖2。從圖2可以看出，料液比在小于1（g）∶30 （mL）之前GABA的提取率逐步遞增，之后變化不大，說明在料液比為1（g）∶30（mL）時，桑葉中的GABA提取已較完全，繼續增大料液比，對提取率的影響不大，反而會增加后續濃縮工作量，因此最佳料液比為1（g）∶30 （mL）。

圖2 料液比對GABA提取效果的影響

2.1.3提取時間 不同提取時間對桑葉GABA提取率的影響見圖3。由圖3可知，提取1～3 h內，隨時間的增加，GABA的提取率增加，超過3 h，產量不但不再增加，反而稍有下降，這可能因長時間在50℃條件下處理對GABA造成破壞，使其降解。因此，選擇提取桑葉GABA的最佳時間為3 h。

圖3 提取時間對GABA提取效果的影響

2.1.4提取次數 對3次抽提的桑葉GABA總量進行分析發現，第1次抽提的得率占88%，第2次占9%，第3次占3%，說明提取1次即可得到大部分的GABA。從節省提取成本、提高提取工效的角度考慮，抽提1次即可。

2.2響應面曲線優化提取工藝

采用BBD法優化桑葉GABA的提取條件。對表2 結果作統計分析，建立三元二次回歸方程：

分析提取量與料液比（X1）、溫度（X2）和提取時間（X3）3個因子對桑葉GABA提取得率的影響，方差分析結果（表3）表明，該模型項回歸極顯著，R2=0.9678，表明該模型與試驗擬合較好，自變量與響應值線性關系顯著，可以用于桑葉GABA水提取試驗的理論預測。在P=0.05顯著水平下剔除不顯著項，得到優化方程為：

2.2.1提取條件因子間的互作效應分析 從回歸系數的顯著性檢驗可以看出，料液比（X1）與提取時間（X3）的互作效應對桑葉GABA提取的影響明顯，對其作響應面圖如圖4所示。從圖4可知，在所設計的試驗條件范圍內，料液比和提取時間都可增加桑葉GABA提取率，二者交互作用表現為桑葉GABA提取量的增大。

表2 Box-Behnken試驗設計桑葉GABA水提法的提取結果

表3 水提法Box-Behnken組合試驗回歸分析

圖4 料液比（X1）和提取時間（X3）對桑葉 GABA提取的交互作用

2.2.2各因素的重要性分析 采用貢獻率法對各因素的重要性進行分析：設各回歸系數顯著性檢驗的均方比為F （j）、F（ij）、F（jj）。各因素對指標的貢獻率可表示為：據表3均方比（F），通過上述公式計算可知，料液比、提取溫度和提取時間對提取率的貢獻率分別為Δ1= 2.2936、Δ2= 1.6249、Δ3= 2.2987，可見對桑葉GABA提取率的貢獻大小依次為提取時間＞料液比＞提取溫度。

2.2.3傳統水提取桑葉GABA條件參數的優化

組合及表證檢驗 通過SAS響應面分析，并結合數學模型水提取桑葉GABA的條件參數，最優組合為：料液比1∶30、提取溫度50℃、提取時間為2.13 h。在此工藝條件下桑葉GABA提取的理論值為0.464%。為進一步檢驗響應面分析法的可靠性，采用上述最優條件進行GABA提取，實際測得桑葉GABA提取量為0.458%，與理論值相近。因此，優化出的浸提條件參數可行。

3　結語

我國桑樹資源豐富，開發桑葉GABA產品，提取是關鍵。為了獲得最高的提取率，進行了桑葉GABA提取的單因素實驗和響應面試驗研究。從單因素試驗結果表明，以蒸餾水為溶液、料液比1（g）∶30（ mL）、50℃、提取3 h、提取1次時，可較好提取桑葉GABA。為進一步優化工藝，選擇萃取溫度（X1）、萃取時間（X2）和料液比（X3）進行Box-Behnken響應面試驗并借助 Design-Expert軟件對模型進行多項式擬合，得到響應值與自變量的響應優化方程為：Y1=4.641667+0.178375X1+0.189375X3-0.788958X12-0.46275X1X3-0.522208X22-0.604458X32。

通過方程推算，得到試驗水平實際因子為料液比1（g）∶30（ mL）、提取溫度50℃、提取時間2.13 h，此工藝條件下提取率為0.464%，其中影響因素貢獻率：提取時間＞料液比＞提取溫度。

本方法提取溫度低，提取過程活性物質不會受高溫影響而破壞，提取過程中無需專門的提取設備，方法簡便，易操作。

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（責任編輯 崔建勛）

Optimization of γ-aminobutyric acid extraction from mulberry leaf by response surface methodology

ZHONG Yang-sheng1，CHEN Heng-wen1，LIN Bi-min2，LIN Jian-rong1，CHEN Fang-yan1
（1.College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2.Public Basic Courses Experimental Teaching Center，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

By seriatim-factorial experiment and Box-Behnken test，the extraction conditions of γ-aminobutyric acid（GABA） from mulberry leaf with water were optimized. The results showed that the extraction rate was 0.464% under the following modification conditions： the ratio of mulberry leaf powder to water was 1（g）∶30（mL） and treated at 50℃ for 2.13 h. The order of the factors influencing the result was extraction time＞ratio of mulberry leaf powder to water＞temperature.

mulberry leaf；γ-aminobutyric acid（GABA）；extraction；Box-Behnken test

S888.2

A

1004-874X（2016）07-0120-06

2016-03-04

國家公益性行業（農業）科研專項（201403064）；國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-22）； 廣東省科技計劃項目（2012B060400014， 2014A020208120）

鐘楊生（1973-），男，博士，講師，E-mail：zhongyangsh@scau.edu.cn

陳芳艷（1971-），女，博士，副教授，E-mail：chenfangyan@scau.edu.cn