RBD+ODC及其突變體融合表達質粒的構建和表達驗證

馬怡暉，龐　霞，許晶晶，夏培苡，高漢青

(鄭州大學第一附屬醫院病理科、河南省腫瘤病理重點實驗室，河南 鄭州 450052)

?

RBD+ODC及其突變體融合表達質粒的構建和表達驗證

馬怡暉，龐霞，許晶晶，夏培苡，高漢青

(鄭州大學第一附屬醫院病理科、河南省腫瘤病理重點實驗室，河南 鄭州 450052)

目的構建RBD+ODC及其突變體融合表達質粒，并進行驗證。方法選取Ras下游效應分子Raf-1中能夠與K-Ras蛋白相互作用的RBD+CRD氨基酸片段作為結合結構域，以ODC蛋白分子全長作為功能結構域。以正常人胰腺組織的cDNA為模板擴增相應的目的基因片段，應用分子克隆的方法通過在引物中引入GS片段使結合結構域和功能結構域相連并通過雙輪PCR法在ODC功能位點引入突變，所獲得的核苷酸片段均連入pcDNA3.1真核表達載體中。結果與結論經測序和Western Bolt驗證，成功構建了RBD+ODC及突變體RBD+ODC的重組質粒，2種質粒均能夠在人HEK293T細胞中正常表達。

結合結構域；功能結構域；RBD；ODC；AZ

[Abstract]ObjectiveTo construct RBD+CRD and mutant RBD+CRD expressing vectors.MethodsThe RBD+CRD was chosen as the binding domain,and full length ODC as function domain,and the two domain were connected by molecular cloning.The mutant “RBD+ODC” was constructed by two step PCR.All the nucleotide fragments were connected into pcDNA3.1 vector.Results and ConclusionRBD+CRD and mutant RBD+CRD were constructed successfully by validation of sequencing and Western blot.

[Key words]binding domain; function domain; RBD; ODC; AZ

生物體內蛋白分子降解的途徑有2種，第1種是泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)，該途徑控制著生物體內絕大多數蛋白質的降解，主要由泛素分子、泛素激活酶E1、泛素轉移酶E2、泛素連接酶E3及26S蛋白酶體構成，通過對底物的泛素化修飾完成對底物蛋白的降解[1]。第2種是鳥甘酸脫羧酶/抗酶系統(ODC/AZ)，其中ODC直接與底物蛋白結合，自身形成二聚體，進一步與抗酶AZ結合后蛋白構像被改變而直接被26S蛋白酶體識別降解[2-4]。相比較于第1種途徑，ODC/AZ系統對蛋白的降解不需要泛素化修飾，因此作用更直接快速。我們擬在前期靶向泛素化降解K-Ras癌蛋白研究的基礎上[5]，嘗試應用ODC/AZ系統實現敲減胰腺癌細胞中K-Ras癌蛋白，而研究的關鍵就是構建能夠與K-Ras癌蛋白相互作用的融合蛋白，該融合蛋白需同時能夠與K-Ras癌蛋白相互結合，又要保留ODC分子的活性作用。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京天根生物有限公司)，DNA聚合酶、dNTP、各種核酸內切酶、T4連接酶(日本Takara公司)，質粒提取試劑盒、lipofection2000轉染試劑、高溶點瓊脂糖(美國lnvitrogen公司)，鼠抗人β-actin單克隆抗體、c-Myc標簽單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，HPR標記二抗(北京中杉金橋生物有限公司)，丙烯酰胺、N’N’-亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸胺、SDS(美國Pierce公司)，DMEM培養基(美國Gibco公司)，胎牛血清(天津灝陽公司)，ECL發光液(北京普利萊公司)。

1.2細胞培養人HEK293T細胞系用DMEM培養基培養于37 ℃、體積分數5% CO2孵箱中。

圖1　雙輪PCR定點突變ODC活性位點示意圖

以mRBD+CRD作為模板，分別應用雙輪引物(A和B)擴增出相應的核苷酸片斷；再以第1輪上游引物和第2輪下游引物作為引物(C)擴增含有突變位點的核苷酸片斷

表1各擴增片段的引物序列

引物名稱引物序列RBD正向5’-CGGGATCCATGGGCAAACTCACAGATCCTTCTAAGACAAG-3’RBD反向5’-TAAAGCGGCCGCGAATTCAGGCATCCTGGAAACAGACTC-3’ODC正向5’-ATTTGCGGCCGCGGTTCCGGTTCCGGTTCCGGTTCCATGAACAACTTTGGTAATGAAGAG-3’ODC反向5’-CTACACATTAATACTAGCCGAAGCACAGGCTGCTCTGTGG-3’mRBD+ODC第1輪正向5’-CGGGATCCATGGGCAAACTCACAGATCCTTCTAAGACAAG-3’mRBD+ODC第1輪反向5’-CACATCCTCAGATCCAGGAAAGGTGGTGCCAATATCAAGC-3’mRBD+ODC第2輪正向5’-GCATGTATCTGCTTGATATTGGCACCACCTTTCCTGGATC-3’mRBD+ODC第2輪反向5’-CTACACATTAATACTAGCCGAAGCACAGGCTGCTCTGTGG-3’

1.4RNA的提取及逆轉錄參照Trizol Reagent試劑盒說明書，提取正常人胰腺組織中的總RNA，采用逆轉錄反應體系合成cDNA，以cDNA為模板擴增相應的目的基因或片段。表2列出了各表達載體中連入核苷酸的理論數目。

1.5測序所有測序工作均委托上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.6融合蛋白表達驗證用RIPA裂解液處理瞬時轉染重組質粒48 h后的人HEK293T細胞，提取相應的蛋白，以β-actin作為內參，采用Western blot方法對不同處理組中攜帶有Myc標簽的融合蛋白表達進行檢測。表2列出了各融合蛋白分子氨基酸理論數目及相應的蛋白相對分子質量。

2　結果

2.1質粒測序驗證所有構建的質粒經測序證實，連入的核苷酸序列是正確的。見圖2。

表2多肽片段在原蛋白分子中的氨基酸位點及選用的酶切位點

片段名稱理論氨基酸殘基位數/aa實際連入氨基酸殘基位數/aa目的片段核苷酸數目/bp融合蛋白相對分子質量(×103)選用酶切位點RBD+CRD/mRBD+CRD51～22046～225195776.0上游BamHI/下游NotIODC1～461(全長)1～461(全長)138354.5上游NotI/下游XhoI

圖2　測序結果(A：RBD+ODC；B:mRBD+ODC)

2.2質粒表達驗證將所構建的2個融合蛋白表達質粒瞬時轉染人HEK293T細胞，于轉染后48 h收集細胞，裂解后上樣檢測各重組質粒Myc標簽表達情況。設立pcDNA3.1空載體轉染組作為對照，以管家基因β-actin作為內參，結果顯示2個融合蛋白表達質粒均可正常表達，蛋白相對分子質量與理論值基本一致。見圖3。

3　討論

蛋白敲減技術是依據泛素-蛋白酶體途徑特異性降解蛋白分子的原理發展而來，通過構建能與底物蛋白特異性結合的融合型泛素連接酶E3蛋白[7-10]或化學合成PROTACS小分子[11-14]，直接在蛋白水平(即翻譯后水平)實現對底物蛋白的降解(即敲減)。因此與傳統的基因沉默技術相比，該技術具有更大的靈活性。我們前期研究應用該策略，構建了能夠與Ras癌蛋白相互結合的融合型E3，該E3通過泛素化途徑靶向敲減了胰腺癌細胞中的K-Ras癌蛋白并抑制了胰腺癌細胞的生長活性。ODC/AZ系統是不同于UPP的另一條蛋白降解途徑，該蛋白降解過程不依賴泛素化修飾，因此受影響因素少，作用更直接快速。理論上，將能夠與底物結合的結合結構域同ODC融合表達，在AZ的催化下，應該可以實現不依賴泛素化修飾的蛋白降解。因次，本研究在前期靶向泛素化降解K-Ras癌蛋白的基礎上，嘗試通過構建能與KRAS相互作用的RBD+ODC融合蛋白，實現對K-Ras不依賴泛素化修飾的降解。實驗結果表明，應用分子克隆手段，我們成功構建了RBD+ODC以及突變體RBD+ODC的重組質粒，2種質粒均能夠在人HEK293T細胞中正常表達。本實驗為下一步深入研究并評價RBD+ODC作為敲減底物蛋白工具的作用有效性奠定了基礎。

圖3　Western Blot實驗結果

[1]Hershko A,Ciechanover A.The ubiquitin system[J].Annu Rev Biochem,1998,67:425-479.

[2]Kahana C,Asher G,Shaul Y.Mechanisms of Protein Degradation An Odyssey with ODC[J].Cell Cycle,2005,4(11):1461-1464.

[3]Elias S,Bercovich B,Kahana C,et al.Degradation of ornithine decarboxylase by the mammalian and yeast 26S proteasome complexes requires all the components of the protease[J].Eur J Biochem,1995,229(1):276-283.

[4]Gandre S,Kahana C.Degradation of ornithine decarboxylase in Saccharomyces cerevisiae is ubiquitin independent[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,293(1):139-144.

[5]Ma Y,Gu Y,Zhang Q,et al.Targeted destruction of KRAS oncoprotein by an engineered ubiquitin ligase suppresses the proliferation of pancreatic adenocarcinoma cell PANC-1[J].Mol Cancer Ther,2013,12(3):286-294.

[6]Matsuzawa S,Cuddy M,Fukushima T,et al.Method for targeting protein destruction by using a ubiquitin-independent,proteasome-mediated degradation pathway[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(42):14982-14987.

[7]Zhou P,Bogacki R,McReynolds L,et al.Harnessing the ubiquitination machinery to target the degradation of specific cellular proteins[J].Mol Cell,2000,6(3):751-756.

[8]Zhang J,Zheng N,Zhou P.Exploring the functional complexity of cellular proteins by protein knockout[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(24):14127-14132.

[9]Hatakeyama S,Watanabe M,Fujii Y,et al.Targeted destruction of c-Myc by an engineered ubiquitin ligase suppresses cell transformation and tumor formation[J].Cancer Res,2005,65(17):7874-7879.

[10]Li X,Shen L,Zhang J,et al.Degradation of HER2 by Cbl-based chimeric ubiquitin ligases[J].Cancer Res,2007,67(18):8716-8724.

[11]Sakamoto KM,Kim KB,Kumagai A,et al.Protacs:Chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation[J].Proc Nat Acad Sci U S A,2001,98(15):8554-8559.

[12]Sakamoto KM,Kim KB,Verma R,et al.Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation[J].Mol Cell Proteomics,2003,2(12):1350-1358.

[13]Carmony KC,Kim KB.PROTAC-Induced Proteolytic Targeting[J].Methods Mol Biol,2012,832:627-638.

[14]Cyrus K,Wehenkel M,Choi EY,et al.Jostling for position:optimizing linker location in the design of estrogen receptor-targeting PROTACs[J].ChemMedChem,2010,5(7):979-985.

Construction and Validation of RBD+CRD and Mutant RBD+CRD Expressing Vectors

Ma Yihui,Pang Xia,Xu Jingjing,Xia Peiyi,Gao Hanqing

(DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

國家自然科學基金青年項目(編號：81401936)

馬怡暉(1978- )，女，博士，副主任醫師，主要從事胰腺癌發病機制研究。E-mail:allsunshine123@126.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.04.001

R735.9;R730.23

A

1673-5412(2016)04-0277-04

2016-05-10)