基于約氏不動桿菌的萘生物降解特性

姜巖，張曉華，楊穎，張賢明

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基于約氏不動桿菌的萘生物降解特性

姜巖，張曉華，楊穎，張賢明

（重慶工商大學廢油資源化技術與裝備教育部工程研究中心，重慶 400067）

萘是典型的多環芳烴，毒害大、難降解，既是重要的環境污染物，又是代表性的石油烴成分，成為各類油污染場地生物修復的難點。礙于其水溶性差而制約了相關研究。利用一株從廢油中分離得到的兼具石油烴降解能力和潤濕反轉無機雜質能力的約氏不動桿菌開展了萘的生物降解特性研究。通過研究降解因素優化出基礎的降解條件；在此基礎上，在50～2000 mg·L-1范圍內研究了該菌對萘的生物降解特性；并利用Monod模型和Haldane模型對比研究了該菌降解萘的動力學行為。結果表明，該菌在以2000 mg·L-1萘為唯一碳源的特定條件下，以5%的接種量可以在146 h左右實現萘的全降解；Haldane模型適合于描述菌株的生長和底物降解行為，而Monod模型只適合于描述低濃度下萘的生物降解特性。

萘；降解；石油；環境；約氏不動桿菌；動力學；底物抑制

引 言

萘是典型的多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs），廣泛分布于大氣、水體、土壤、作物和食品中，也是各類油品中重要的石油烴成分，進入環境后成為難降解有毒害污染物[1-3]。美國環保署早在20世紀80年代初就已經將其列為環境中優先檢測污染物[4]。

PAHs有多種遷移、轉化途徑，其中微生物降解是去除PAHs的最主要途徑[5]。目前，已經證實有近20個屬種的微生物能夠降解萘，研究成果涵蓋了菌種的篩選、降解特性研究、代謝途徑分析等[6-8]。其中，假單胞菌屬（sp.）作為最重要的代表性環境微生物能夠降解包括萘等在內的多種污染物，得到最為廣泛的研究[9-11]。Pathak等[12]曾發現一株sp. HOB1在特定條件下能夠快速降解高達2000 mg·L-1以上的萘。不動桿菌屬（sp.）也廣泛存在于各類污染環境中，已經證實該菌屬亦可利用部分PAHs作碳源實現生物降解[13-14]；不僅如此，其中的部分菌種還具有在油水兩相間潤濕反轉油相固體粒子的特性[15-16]；近年來該菌屬受到越來越多的關注。除上述常見菌屬外，其他的部分菌屬也得到了越來越多的認識，如鏈霉菌屬（sp.）中的一些菌可以在12 h內降解超過80%的低濃度萘[13]。

本文即是利用從廢油中分離得到的一株約氏不動桿菌[15-17]，以萘為典型PAHs污染物，研究萘的生物降解條件、降解特性、動力學行為，為進一步研究PAHs的環境污染治理以及廢油的生物處理奠定實驗基礎。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗菌株

約氏不動桿菌是本實驗室以廢油為分離材料，經分離、純化和16S rRNA鑒定得到，并已證實該菌具有良好的石油烴降解特性[17]。

1.2 培養基

富集培養基（LB培養基）：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 L，pH7.0～7.2。

無機鹽培養基：硝酸銨1 g，磷酸二氫鉀0.4 g，磷酸氫二鉀0.8 g，氯化鈣0.05 g，硫酸鎂0.05 g，硫酸亞鐵0.05 g，氯化鈉0.8 g，蒸餾水1 L；pH7.0～7.2。以萘作唯一碳源，將萘溶解于丙酮中制備成儲備液；再將萘丙酮溶液分裝在30 ml預熱至37℃的無機鹽培養基中；最后在37℃恒溫水浴中揮發丙酮；根據丙酮用量的不同，其揮發時間在0.5～8 h左右。無機鹽培養基中初始萘濃度以接種前色譜檢測結果為準。

1.3 實驗方法

保藏在斜面的菌種接種至10 ml的LB培養基中，經過夜培養后，以1%～2%的接種量繼續富集培養1代，嚴格控制種子液的OD6001.20±0.02；萘的生物降解以接種種子液至30 ml無機鹽選擇培養基中開始，萘的濃度根據具體實驗目的而定；以不接種細胞的樣品作空白對照，用以監測生物降解過程中萘的揮發；在160 r·min-1下搖床培養，定期檢測殘留于溶液中的萘濃度。

基于上述基本實驗方法，在條件優化實驗中，溫度、接種量、pH根據實驗設定水平，其他實驗研究均采用優化的參數條件；在動力學研究中，以降解實驗所得數據為基礎，分別利用Monod和Haldane模型對比研究約氏不動桿菌降解萘的細胞生長和底物降解動力學行為。

1.4 分析方法

細胞濃度采用紫外分光光度法測定，在600 nm波長下測定發酵液的吸光度[18]；細胞干重采用重量法測定，將吸光度值轉化為細胞干重[19]。

底物濃度采用SHIMADZU LC-20A高效液相色譜儀測定。檢測條件為：SPD-M20A紫外檢測器、CTO-20A柱溫箱、LC-20AD泵、色譜柱為C18反相柱（150 mm×4.6 mm，50 μm），LC-Solution色譜工作站，檢測波長為254 nm，流動相為甲醇:水85:15，流速為1 ml·min-1，柱溫為25℃，進樣量20 μl，出峰時間3.86 min。

樣品和相應空白均做3個平行樣，初始萘濃度均為色譜實測結果，考慮到實驗條件下萘的揮發性，因此被細胞利用的萘（mg·L-1）按照下式計算：細胞降解的萘（樣品初始萘樣品中殘留萘）（空白初始萘空白中殘留萘）。

2 實驗結果與討論

2.1 溫度對約氏不動桿菌降解萘特性的影響

溫度通過影響細胞內代謝酶系的活力而影響細胞對底物的降解能力。本文對比研究了溫度在30、35、37、40和43℃下，以10%的接種量，1000 mg·L-1的萘生物降解72 h后細胞生長與底物降解情況（圖1）。在該反應時間內，所有反應體系內的萘均不能實現全降解，該實驗設計有利于對比研究反應條件的影響。可以看出，在各溫度條件下，細胞生長與底物降解呈現出一致的規律。溫度增加，萘的生物降解作用加強，更多的底物消耗用以合成新細胞，表現為細胞濃度增加；在35～40℃范圍內，約氏不動桿菌表現出旺盛的代謝活力，在37℃時接近降解高峰，此時，萘的去除率接近77%，相應的細胞干重達到402.8 mg·L-1，表明這株約氏不動桿菌在1000 mg·L-1萘的反應體系中表現出優良的生長和降解特性。由于該菌株在前期分離、馴化等過程中均是在中溫環境中進行的，而鑒于可能存在的溫度波動，本文也考察了其耐熱性。從圖1可見，當溫度超過40℃時，萘的生物降解作用明顯下降，特別是在溫度達到43℃時，細胞的生長和代謝受到顯著抑制。這一現象與王春明等[20]在高溫環境中由于萘的大量揮發造成底物限制作用不同，在本實驗體系中，尚有大量底物殘留，表明生物降解作用的下降是由于細胞在特定反應體系中不能耐受高溫環境而造成活力下降所致。與高溫環境相比，隨著溫度的下降，細胞活力也受到抑制，但在考察的溫度范圍內下降趨勢較為平緩。在35～40℃保持較高的生物降解活性足以保障該菌的應用研究。

圖1 約氏不動桿菌在不同溫度下的細胞生長與萘降解

2.2 接種量對約氏不動桿菌降解萘特性的影響

將約氏不動桿菌經兩次LB培養基活化后，采用不同的接種量轉接到含萘選擇培養基中。圖2為約氏不動桿菌在2%、5%、8%、10%、15%的接種量條件下，分別降解1000.7 mg·L-1萘的細胞生長與底物降解情況。不同的接種量會導致在反應體系中初始細胞濃度的差異，細胞濃度越高微生物越容易存活，越有利于擺脫延滯期而進入對數生長期，實現對萘的降解；反之，微生物則需要經過較長時間進行物質和能源的儲備后才能實現對底物的快速降解。因此，在72 h的生物降解周期內，細胞濃度和萘的去除率均隨接種量增加而增大。此外，接種量越高，接種體細胞在進入新環境后耐受有機毒性保持相對高活力的能力越強，也是導致最終獲得了相對較高的萘去除率和生物量的重要原因。

不過，細胞濃度的差異隨著生物降解作用的繼續而逐漸減小。從圖中可以看出，當菌株歷經不同的生物降解周期實現對萘的全降解后，在各反應體系中最終的細胞濃度差別不大，畢竟各反應體系中的初始碳源是完全相同的，這決定了最終生物量的多少；從細胞生長曲線上反饋出的最終細胞濃度差異也僅在20 mg·L-1左右。此外，一個現象值得關注，以2%的接種量進行1000 mg·L-1萘的生物降解時，當反應時間超過4 d后，反應體系中殘留的萘在消除揮發干擾后濃度基本保持不變，萘的去除率從生物降解72 h的58%提高到最大89%左右。這一實驗經多次驗證，均得到非常相近的實驗結果，即生物降解能夠進行，但該菌株在特定體系中無法實現對萘的全降解，其原因有待深入的實驗分析。綜合考慮降解效果和處理成本，5%的接種量被用于后續實驗研究中。

2.3 初始pH對約氏不動桿菌降解萘特性的影響

無機鹽培養基的初始酸堿環境對菌株降解萘產生較大影響。圖3指出，當初始pH降低到6.6以下時，細胞的活力快速下降；當達到5.5時，1000 mg·L-1萘的去除率在消除其揮發干擾后僅為38%左右。穩定的生物降解作用發生在pH為6.6至偏堿性范圍內，表現為細胞生長穩定，在經過72 h的生物降解后，萘的去除率均保持在70%左右，說明該菌株至少在近中性范圍內能夠保持較高的活力。實驗還發現，當初始pH超過7.3時出現一個嚴重問題，無機鹽培養基的溶解度下降，即便在39℃的溫度環境下進行溶解也會出現明顯的沉淀現象，因此，本文主要研究了在初始pH低于7.3時萘的生物降解特性。

圖3 約氏不動桿菌在不同初始pH下的細胞生長與萘降解

2.4 約氏不動桿菌對萘的最大耐受濃度

圖4是菌株在初始萘濃度為1600、1800、2000 mg·L-1的選擇培養基中萘的揮發以及細胞生長和底物降解情況。萘的揮發性除了受溫度影響很大以外，也受到萘濃度的影響，特別是對于高濃度萘溶液，萘的揮發尤為明顯，隨著萘濃度從1600 mg·L-1增加至2000 mg·L-1，其揮發率提高了5%左右。消除萘的揮發干擾后，從細胞生長和底物降解曲線清晰可見，在極限濃度中，隨著底物增加，細胞克服底物抑制作用經歷了更長的生長延滯期，為底物的快速降解和新細胞的合成貯備能源和物質基礎。以2000 mg·L-1的最大耐受濃度為例，在反應前70 h細胞一直處于生長延滯期，萘的快速降解發生在整個反應的后半階段，在70 h以后，細胞逐漸進入旺盛代謝階段，濃度迅速增加，因此實現了萘的快速降解，表現為降解曲線陡降。另外，底物濃度越高，最終的生物量越大。不過，隨著底物濃度的不斷增加，細胞得率減小，從1600~1800 mg·L-1細胞濃度增加了71 mg·L-1，而從1800～2000 mg·L-1細胞濃度僅增加了57 mg·L-1，其差值是由于消耗的萘用以克服高濃度反應體系中更加強烈的底物抑制作用，以維持自身的生長，最終導致細胞得率降低。2000 mg·L-1即為約氏不動桿菌在特定培養條件下的最大耐受濃度；當底物濃度繼續以50 mg·L-1增加時，生物降解作用停止。

圖4 約氏不動桿菌在高濃度含萘培養基中的細胞生長與萘降解

2.5 約氏不動桿菌降解萘動力學研究

在50～2000 mg·L-1范圍內研究了約氏不動桿菌降解萘的細胞生長與底物降解特性。

2.5.1 約氏不動桿菌降解萘的細胞生長動力學

（1）Monod方程

采用Monod方程模擬不同初始濃度萘生物降解動力學，為求得Monod方程參數max及S，采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法求解。各初始底物濃度下的Monod方程結果如表1所示。

表1 約氏不動桿菌降解不同初始濃度萘的細胞生長動力學

Note: “—” indicates negative value.

由表1可見，當萘的濃度為50 mg·L-1時，采用雙倒數作圖法擬合的直線20.995，1/max與1/具有良好的線性關系，Monod方程適合描述該菌在特定環境中的細胞生長行為。但是，當萘濃度增大到100 mg·L-1后，相關系數減小到0.950，且隨著初始萘濃度的增加而逐漸減小，直至底物濃度增大到400 mg·L-1時，斜率S為負值，此時，1/max與1/之間已不存在線性關系。當初始萘含量較低時，底物對菌株的抑制作用小，此時，反應體系主要表現為底物限制作用，反應體系中的萘總體表現為對微生物生長的促進作用，細胞只需經過短暫的調整期即可進入旺盛生長階段，表現為快速增長的細胞比生長速率和底物比降解速率；反之，當初始底物濃度較高時，由于有機毒性對細胞產生抑制作用，而這種抑制在Monod模型中并未通過在Haldane模型中的底物抑制常數得以體現，因此，在底物增加到一定濃度后再以1/max對1/作圖時，斜率出現負值。不過，在任一特定高濃度底物的生物降解體系中，隨著底物消耗與細胞累積，底物對微生物的抑制作用逐漸減小，細胞比生長速率逐漸提高。上述研究表明，當反應體系中初始底物濃度較低、有機毒性較小時，Monod方程能夠描述細胞的生長過程；反之，則不適合。不過，對于不同的生物降解體系，Monod方程有其不同的底物濃度適用范圍。

（2）Haldane方程

采用Haldane方程對不同初始濃度的萘生物降解過程中細胞生長行為進行動力學模擬[18,21]，將所得實驗數據運用MATLAB軟件使用非線性最小二乘法進行回歸，得到約氏不動桿菌降解萘的細胞生長動力學方程

回歸過程中得到的殘差是1.52×10-3。圖5是不同初始萘濃度下約氏不動桿菌比生長速率的實驗值與理論值對照。由圖可知，回歸曲線與實驗數據點吻合良好，表明Haldane方程適合描述約氏不動桿菌降解萘的動力學行為。其中，細胞的最大比生長速率發生在初始萘濃度為174 mg·L-1，在曲線左側部分，反應體系中主要表現為底物限制作用，即碳源的不足限制了細胞生長；而在最高點右側則是底物抑制作用占主導，有機毒性抑制了細胞生長；同其他相關動力學研究體系相比，萘對該菌株表現出抑制作用的濃度相對較高[22-24]。這一結果也再次證實，Monod模型不適用于高濃度底物的實驗體系（表1）。

圖5 不同初始萘濃度下的細胞生長動力學模型預測值與實驗數據點的對照

2.5.2 約氏不動桿菌降解萘的底物降解動力學

將回歸得到的細胞比生長速率與萘比降解速率進行線性擬合，得到約氏不動桿菌降解萘的動力學方程

圖6是在不同初始萘濃度下，利用實驗數據得到的萘比降解速率與用MATLAB回歸出的比降解速率的對照。可以看出利用Haldane模型回歸出的方程曲線與實驗數據點吻合良好，表明Haldane方程能夠用來表征約氏不動桿菌降解萘的動力學行為。當底物濃度從174 mg·L-1增加至1000 mg·L-1時，細胞從底物飽和狀態進入到底物抑制環境中，有機毒性對細胞的抑制作用迅速增加，因此，底物比降解速率下降較快；而在高濃度有機環境中，細胞處于相對穩定的狀態，在不同初始濃度的底物環境中，無論是細胞比生長速率還是底物比降解速率差別并不明顯，綜合細胞降解曲線分析（圖4），此時能否實現生物降解主要取決于細胞能否克服底物抑制作用而擺脫生長延滯期。

圖6 不同初始萘濃度下的萘降解動力學模型預測值與實驗數據點的對照

3 結 論

（1）實驗用約氏不動桿菌在35～40℃的中溫環境中保持了相對穩定的降解能力，特別在37 ℃下表現出最佳的降解能力；接種量對該菌的降解特性也產生較大影響，過低的接種量會導致該菌在特定的萘濃度中不能實現對底物的全降解，綜合考量處理成本選擇5%的接種量。

（2）從廢油中分離得到的約氏不動桿菌具有較強的降解萘能力：該菌能夠以萘作準一碳源實現代謝；在低于174 mg·L-1的初始底物濃度中，反應體系主要表現為底物限制作用，相比于其他生物降解體系，這一極限值較高，體現出該菌對于萘的耐受性較強；在優化條件下，該菌株對萘的最大耐受濃度可以達到2000 mg·L-1，并能實現全降解。

（3）動力學對比研究發現，在本實驗體系中，Haldane模型適合于描述在不同初始萘濃度下的細胞生長和底物降解行為；而Monad模型只適合于描述低濃度下萘的生物降解特性，當生物降解體系表現為底物抑制作用占主導時，該模型不再適用。

符 號 說 明

CS——底物濃度 KS——半飽和常數 R2——線性相關系數 μ——細胞比生長速率 μmax——最大比生長速率

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Naphthalene biodegradation by

JIANG Yan, ZHANG Xiaohua, YANG Ying, ZHANG Xianming

(Engineering Research Center for Waste Oil Recovery Technology and Equipment of Ministry of Education,Chongqing Technology and Business University, Chongqing 400067, China)

Naphthalene, typical of polycyclic aromatic hydrocarbons, is highly poisonous and hardly degradable. As the typical petroleum hydrocarbon composition, it is a severe environmental pollutant, and therefore there exists great difficulty in the bioremediation of oil-contaminated sites. Due to its poor water solubility, researches on naphthalene degradation are hindered seriously. In this paper, the strain ofisolated from waste oil is employed to study naphthalene biodegradation with the ability both to degrade petroleum hydrocarbon and to wet inorganic impurities. The reaction conditions are optimized based on the researches on degradation factors and the biodegradation characteristics of naphthalene are manifested in the range of 50 to 2000 mg·L-1. The dynamics behavior of.is studied on the degradation of naphthalene through the comparison of the Monod model and the Haldane model. The results indicated that the strain could utilize naphthalene as sole carbon and energy source to metabolize and 2000 mg·L-1naphthalene could be entirely degraded within about 146 h at 5% inoculum volume and 37℃. The Haldane model is suitable to describe cell growth and the substrate degradation behaviors while the Monod model is appropriate to depict naphthalene biodegradation with low initial concentration.

naphthalene; degradation; petroleum; environment;; kinetics; substrate inhibition

supported by the National Natural Science Foundation of China (21376285), the Natural Science Foundation of Chongqing (CSTC2013jcyjA20014), Chongqing Key Project of Applied Technology Development (cstc2014yykfB90002), Chongqing Board of Education Key Project of Science and Technology (KJZH14210) and the Scientific Platform Project, Ministry of Education (FYKF201506).

date: 2016-01-03.

Dr. JIANG Yan, jiangyan@ctbu.edu.cn

X 592；X 172

A

0438—1157（2016）09—3981—07

10.11949/j.issn.0438-1157.20151992

國家自然科學基金項目（21376285）；重慶市自然科學基金項目（CSTC2013jcyjA20014）；重慶市應用技術開發重點項目（cstc2014yykfB90002）；重慶市教委科技資助重點項目（KJZH14210）；教育部平臺科技資助項目（FYKF201506）。

2016-01-03收到初稿，2016-05-06收到修改稿。

聯系人及第一作者：姜巖（1971—），男，博士，教授。