煙草青枯病拮抗菌在有機肥中的定殖效率及田間防治效果

孫立廣，張洪春，趙秀云，王 瑞，向必坤，彭五星，孫玉曉，尹忠春，譚 軍*

（1.華中農業大學農業生命科學技術學院，武漢 430070；2.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北 恩施 445000；3.湖北省煙草公司宣恩縣煙葉分公司，湖北 宣恩 445000）

煙草青枯病拮抗菌在有機肥中的定殖效率及田間防治效果

孫立廣1，張洪春1，趙秀云1，王 瑞2，向必坤2，彭五星3，孫玉曉3，尹忠春3，譚 軍2*

（1.華中農業大學農業生命科學技術學院，武漢 430070；2.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北 恩施 445000；3.湖北省煙草公司宣恩縣煙葉分公司，湖北 宣恩 445000）

為有效防治青枯病，采用多種拮抗菌復配菌劑添加至生物有機肥，施用于煙田，研究其對煙田土壤中有益微生物、病原微生物的影響及對青枯病的控制效果。結果顯示，30%茶枯+70%煙草秸稈粉碎物（生物有機肥C）中添加的拮抗菌有較好的定殖率，枯草芽胞桿菌JK-4、解淀粉芽胞桿菌JK-10菌株在生物有機肥C中的定殖率分別達到了945.7%、1970%，鏈霉菌LC-7菌株在生物有機肥C中定殖率達到496.7%，同時其防治青枯病的效果最好，在煙草旺長期防治效果達到57.40%，在青枯病發病高峰期防治效果為37.11%。

煙草青枯病；生物有機肥；芽胞桿菌；鏈霉菌；防治效果

煙草青枯病是一種煙草土傳病害，其爆發會造成巨大的經濟損失［1］。為防止青枯病發生，利用添加拮抗微生物的有機肥防治青枯病正成為研究熱點。目前有機肥與功能微生物（生防菌、促生菌等）相結合制成的微生物有機肥對各種土傳病害的防控表現出很好的效果［2-5］。但是單一菌種、單一功能的生防菌已不能滿足農業發展的需求。本研究將篩選獲得的多種青枯雷爾氏菌的拮抗菌發酵菌液添加到不同種類的有機肥中，檢測定殖情況；同時將添加拮抗菌劑的有機肥施用于煙田，監測煙田土壤中青枯雷爾氏菌及拮抗菌的數量變化以及青枯病發病情況，篩選出效果最佳的生物有機肥組合，期望有助于改變目前青枯病生防藥劑單一的現狀，獲得防治煙草青枯病的新途徑。

1　材料與方法

1.1材料

煙草青枯雷爾氏菌由發病煙草植株分離并在實驗室保存。添加的拮抗菌為華中農業大學微生物實驗室保存菌株，分別為鏈霉菌 LC-7菌株（Streptomyces sp.）、甲基營養型芽胞桿菌（Bacillus methylotrophicus）JK-3菌株，枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）JK-4菌株，解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）JK-10菌株，已確認有良好的抑制青枯雷爾氏菌的活性。平板噴霧法：挑取細菌單菌落，點樣至PDA培養基平板上，倒置放入28 ℃恒溫培養箱中培養24 h后，在平板上噴霧接種對數期的青枯雷爾氏菌，放入28 ℃培養箱，24 h后觀察是否有抑菌圈。

設置的5種有機肥處理由湖北省恩施州煙草公司提供，分別為生物有機肥A：100%煙草秸稈粉碎物；B：30%菜枯+70%煙草秸稈粉碎物；C：30%茶枯+70%煙草秸稈粉碎物；D：30%菜枯+30%炭化谷殼+40%煙草秸稈粉碎物；E：30%茶枯+30%炭化谷殼+40%煙草秸稈粉碎物。

田間試驗在宣恩縣曉關鄉古路村進行，選擇煙草青枯病發生嚴重的黃棕壤進行試驗，供試品種為云煙87。

1.2試驗設計

1.2.1拮抗菌共培養試驗 采用平板對峙法，將拮抗菌分別點接在平板上，點接距離2 cm，在培養箱中恒溫培養5～7 d，觀察菌株生長是否會互相影響。

1.2.2拮抗菌在有機肥中的定殖和存活率測定 5種不同有機肥分別在121 ℃高溫滅菌30 min。將培養的4種拮抗菌菌株發酵液按10%（V/W）的接種量分別加入到滅菌有機肥中，放置于 37 ℃培養箱中，每天手動搖翻來進行混勻，3 d后，取發酵的有機肥10 g，溶于90 mL無菌水中，系列梯度稀釋，選擇合適稀釋度涂布牛肉膏蛋白胨培養基或高氏一號培養基平板，培養3～5 d后，計算單菌落數量，計算每種拮抗菌在有機肥中的含菌量。

1.2.3將拮抗菌加入有機肥進行二次發酵 將各個功能菌的菌株發酵液（109CFU/mL）按1%（V/W）的量分別加入到腐熟好的生物有機肥A-E中，固體發酵，發酵溫度30～45 ℃，發酵過程中每天翻堆一次，發酵5～7 d。分別將各個菌固體發酵獲得的菌劑等體積混合，并后熟2～3 d，后熟過程中翻堆2次，最后在溫度不超過 60 ℃的條件下將微生物有機肥的含水量蒸發至50%左右。獲得含有拮抗菌的生物有機肥BOF A-E。

1.2.4田間施用生物有機肥 分別以施用5種不同生物有機肥（BOF A-E）為5個處理，每個處理重復3次，每個小區植煙60株。移栽前將BOF肥料施于土壤中，施用量為200 g/株。同時以施用100%化肥的處理作為對照，養分差均用化肥補齊。所有處理氮磷鉀的施入總量相等。生物有機肥A-E施用量為200 g/株，移栽前均勻施撒于田間；移栽后的30和60 d，使用拮抗菌稀釋5倍的發酵液灌根處理，每株100 mL，肥料所施小區分別標記為SF-1—SF-5。按常規施肥量施化肥，不使用有機肥，作為對照組，所施小區標記為SF-6。

1.2.5病情調查 自移栽后出現第1株發病植株起，每隔15 d詳細調查病情狀況，并記錄直至煙草成熟期。青枯病的病情指數按照中華人民共和國煙草行業標準煙草病害分級及調查方法調查。煙草青枯病的發病率、病情指數和防治效果按下式計算：

發病率=發病植株/調查植株總數×100%

病情指數=Σ［（病情級數×此級株數）/（最高級數×總株數）］×100

防治效果=（對照病情指數－處理病情指數）/對照病情指數×100%。

1.2.6煙田青枯雷爾氏菌和拮抗菌數量的檢測分別在田間施用有機肥30，60，90 d后以及青枯病發病高峰期取土壤樣品，帶回實驗室，10倍系列梯度稀釋后，涂布在TTC培養基上，培養后計算青枯雷爾氏菌的數量。同時分別用高氏一號培養基和NA培養基培養后，計算放線菌和芽胞桿菌的數量。

2　結　果

2.1拮抗菌共培養試驗

如圖1所示，平板上的不同菌株在生長中并不會相互產生明顯的抑制作用，所有菌株的共培養試驗均顯示各個拮抗菌之間的生長并不會相互產生影響。

圖1　拮抗菌共培養結果Fig. 1 Antagonistic bacteria co-culture results

2.2拮抗菌在有機肥中的定殖

從表1可以看出，拮抗菌株在大部分有機肥中的定殖率均比較高，均顯示了較好的定殖結果。從總體來看，有機肥C的定殖結果最好，所有拮抗菌都有較高的定殖率，其中 JK-3的定殖率達到了4595%，JK-3的定殖率在所有組別中最高。其次有機肥B與有機肥E也有較好的定殖結果，但在這兩種肥料中，LC-7的定殖率則明顯低于有機肥C。在有機肥A與有機肥D中，3種細菌的定殖率都比較高，但LC-7卻不能在其中很好的定殖。可見，在拮抗菌定殖試驗中，有機肥C可以很好地促進各拮抗菌的生長，其次是有機肥B與有機肥E。

表1　拮抗菌株在5種生物有機肥中的定殖Table 1 Colonization of antagonistic strains in five bio-organic fertilizers

2.3土壤中青枯雷爾氏菌和拮抗菌的檢測

分別在移栽后30、60、90 d以及青枯病發病高峰期進行采樣檢測。

2.3.1土壤中青枯雷爾氏菌數量 從表2可以看出，在發病高峰期，添加拮抗菌和生物有機肥的5個小區土壤中青枯雷爾氏菌數量明顯少于對照組的數量，其中 SF-1處理組土壤中的青枯雷爾氏菌數量最少。處理組 SF-1在各個時期土壤青枯雷爾氏菌數量如圖2所示，由于青枯雷爾氏菌在各個土樣中不同時期含量的變化波動范圍較大，縱坐標采用菌含量的對數值。可以看出在30至90 d青枯雷爾氏菌在土壤中的含量呈上升趨勢，但90 d至發病高峰期明顯下降，說明添加拮抗菌的有機肥在生長后期可以抑制煙田土壤中青枯雷爾氏菌的生長。可見 5種添加了拮抗菌劑的有機肥均可以有效地降低土壤中青枯雷爾氏菌的數量，預防青枯病的發生。

表2　不同處理發病高峰期土壤中青枯雷爾氏菌數量Table 2 The number of Ralstonia solanacearum in different soil samples in peak period

圖2　SF-1處理不同時期土壤中青枯雷爾氏菌數量Fig. 2 The number of R. solanacearum in different periods in SF-1 soil

2.3.2土壤中拮抗菌的跟蹤監測 土壤中鏈霉菌LC-7的檢測結果如圖3。在發病高峰期，SF-3處理組檢測到的菌含量最高，同時期 SF-3處理組的青枯雷爾氏菌數量明顯少于對照組，能很好的抑制青枯雷爾氏菌的生長。放線菌能產生多種抗生素，對抑制土壤中病原菌的繁殖起到了關鍵作用。放線菌數量最高的 SF-3土樣各個時期的放線菌數量如圖4所示。在發病高峰期，放線菌數量明顯增加，這有利于抑制土壤中病原菌的生長和繁殖。

圖3　不同處理發病高峰期土壤中鏈霉菌數量Fig. 3 The number of Streptomyces strain LC-7 peak period in soil samples

圖4　SF-3處理不同時期土壤中放線菌數量Fig. 4 The number of Actinomycetes in different periods in SF-3 soil

發病高峰期不同處理組土壤中的芽胞桿菌含結果如圖5所示，其中SF-1處理組含菌量最多，達到了 8.9×108CFU/g土，其他處理組芽胞桿菌的含量也基本保持在相同的水平，都達到了107這個數量級。含菌量最多的 SF-1處理組各個時期芽胞桿菌的數量如圖6所示，相比于90 d時，發病高峰期芽胞桿菌的數量有所下降，但仍維持在一個較高的水平。

圖6　SF-1處理不同時期土壤中芽胞桿菌數量Fig. 6 The number of Bacillus in different periods in SF-1soil

2.4青枯病田間防治效果

對各個處理在不同時期的青枯病發病情況進行了調查并統計，結果見表3。從表中可以看出，5種添加了拮抗菌劑的有機肥均可以抑制煙草青枯病。在團棵期，對照組的發病率為53.70%，而處理組中最高的發病率為 38.89%（SF-5），最低只有24.07%（SF-3）。隨著時間推移，處理組的防效略有下降。在成熟期，最高的防治效果為SF-3處理組，防效達到了37.11%。

隨著進入發病高峰期，各個小區內的煙草發病率都呈上升的趨勢。如圖7所示，施用生物有機肥C的SF-3土樣，在各個時期發病率都低于其他處理組，表現出較好的抗病能力。

表3　田間試驗中各時期青枯病發病率和防治效果 %Table 3 The incidence and control efficacy of bacterial wilt at different periods in field experiments %

各處理組的防治效果如圖8所示，施用有機肥土樣的煙草在初期防治效果均超過了30%，隨著煙草的生長，施用不同有機肥的土樣在煙草生長過程中表現出了不同的變化趨勢，隨著發病高峰期的到來，防治效果有所下降但仍保持在一定水平，其中生物有機肥C在高峰期防治效果最佳，達到37.11%。

圖7　田間試驗中煙草各時期青枯病的發病率Fig.7 The incidence of tobacco bacterial wilt in field experiments in different periods

圖8　田間試驗中生物有機肥對青枯病的防治效果Fig. 8 The control efficacy of bio-organic fertilizers on tobacco bacterial wilt in field experiments

3　討　論

生物有機肥可以促進土壤養分的釋放，增加土壤肥力，利于植物的吸收，同時產生的抑菌物質和生長調節因子可以有效地抑制植物病蟲害的發生并促進植物穩健生長［6］。生物有機肥的防病效果，已經突破了它傳統上增加肥力作用，受到了廣泛的關注［7-8］。

研究了5種不同生物有機肥添加復合拮抗菌劑后對煙草青枯病的防治效果發現，添加了復合拮抗菌劑的生物有機肥都能夠減少土壤中青枯雷爾氏菌的數量，同時一定程度上減少了煙草青枯病的發生，雖然隨著時間推移各處理組青枯病發病率呈上升趨勢，但在發病高峰期仍表現出穩定的防效，其中，SF-3處理組在發病高峰期對青枯病防治效果最高，達到37.11%。生物有機肥由于添加了煙草青枯菌復合拮抗菌劑，包括芽孢桿菌、鏈霉菌等［9-13］，這些有益菌在土壤中定殖并大量繁殖后，可以在煙草植株的根際成為優勢菌株，產生的抗生素類物質對病原菌具有一定的抑制作用，因此可以減少青枯病的發病。其中芽胞桿菌通過空間和營養位點競爭、產生抗菌物質、溶菌作用以及誘導植物產生抗性幾種方式綜合達到防治效果［14］，而鏈霉菌則會產生抗生素［15］。徐福樂等［16］利用添加復合菌劑的生物有機肥對番茄青枯病的防治效果達到了69%，另外添加的有益菌還會分泌多種代謝產物，有助于煙草的生長，提高抗病能力［17-18］。除此之外生物有機肥還會增加煙草植株過氧化物酶等酶活性的提高，增強抵御病蟲害的能力，降低病害的發生［19］。試驗中觀察各處理組的發病情況，可以明顯看出與對照組相比，各處理組的發病時間均向后推遲，施用有機肥C的SF-3土樣在煙草旺長期的發病率為30%，大大低于對照組的71%。丁傳雨等［20］的研究也發現生物有機肥能夠延緩青枯病的發病時間。

生物有機肥中添加的有益菌無毒害，不污染環境，成功定殖后可以長期發揮作用，而且可以改變土壤中的微生物群落結構［21］，使病原菌數量減少，同時生物有機肥能夠提供植株生長所需的各種微量元素和大量有機物質，提高土壤供肥能力。施用生物有機肥對改善土壤質量［22］，提高土壤更新恢復能力，防治土傳病害具有十分重要的意義［23-24］。

4　結　論

施用的5種生物有機肥可以在一定程度上降低青枯病的發病率。拮抗菌定殖率、發病率統計等結果說明，有機肥C為最佳的有機肥配比，最適宜拮抗菌定殖，可以較好地防治青枯病。生物有機肥的使用將對保護環境，提高煙草產量，保證煙草產業健康發展做出貢獻。其施用方式與施用量還需進一步研究。

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Colonization Rate of Several Antagonistic Bacteria against Tobacco Bacterial Wilt in Organic Fertilizers and Control Efficacy in Field

SUN Liguang1， ZHANG Hongchun1， ZHAO Xiuyun1， WANG Rui2， XIANG Bikun2，PENG Wuxing3， SUN Yuxiao3， YIN Zhongchun3， TAN Jun2*
（1. College of Life Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China； 2. Enshi Tobacco Company of Hubei Province， Enshi， Hubei 445000， China； 3. Xuanen Tobacco Company of Hubei Province， Xuanen， Hubei 445000， China）

For effective prevention and treatment of bacterial wilt， a variety of antagonistic bacterial agents were added to bio-organic fertilizers and applied to tobacco fields. The effects of composite microbial agents added in the bioorganic fertilizers on tobacco beneficial soil microbes， pathogenic microorganisms， and on bacterial wilt control were studied. The results showed that 30%+70% of the dry tea pulverized tobacco stalks （bio-organic fertilizer C） added with antagonistic bacteria had better colonization， with colonization rate of Bacillus subtilis JK-4 and Bacillus amyloliquefaciens strain JK-10 reached 945.7% and 1970% in the biological organic fertilizer C. The Streptomyces strain LC-7 set in bio-organic fertilizer C with a colonization rate of 496.7 percent. The best prevention of bacterial wilt was obtained with this treatment， with a control effect of 57.40% during the fast growing period of tobacco and a control effect of 37.11% at the peak of incidence of bacterial wilt.

tobacco bacterial wilt； bio-organic fertilizer； Bacillus； Streptomyces； control efficacy

S435.72

1007-5119（2016）04-0048-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.04.009

中國煙草總公司科技重點項目“基于宏基因組學的植煙土壤健康評價研究與應用”（110201402016）；湖北省煙草公司重點項目“煙草秸稈生物有機肥原料多元化研究與開發”（027Y2015-004）

孫立廣，男，碩士，研究方向為土壤微生物。E-mail：18607188382@qq.com。*通信作者，E-mail：1139560054@qq.com

2015-07-16

2016-08-03