山楂HPLC指紋圖譜研究

龍鳳，謝鎮(zhèn)山，高新開，黃月純，曹子豐，魏剛*

[1.無限極(中國)有限公司，廣東 江門 529156；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405]

山楂HPLC指紋圖譜研究

龍鳳1，謝鎮(zhèn)山2，高新開1，黃月純3，曹子豐1，魏剛2*

[1.無限極(中國)有限公司，廣東 江門 529156；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405]

目的：優(yōu)化山楂高效液相色譜指紋圖譜分析方法。方法：色譜柱為ZORBAX SB C18柱；流動(dòng)相為乙腈-1%乙酸溶液，梯度洗脫；檢測(cè)波長為238 nm；柱溫為35 ℃；流速為1.0 mL·min-1。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件(2004A版)進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：不同來源的10批山楂樣品均標(biāo)示出12個(gè)共有峰；10批樣品的相似度為0.964～0.995，提示山楂成分質(zhì)量較穩(wěn)定。結(jié)論：本方法準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，為山楂質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

山楂；指紋圖譜；高效液相色譜法

山楂為薔薇科植物山里紅CrataeguspinnatifidaBge.var.majorN.E.Br.或山楂CrataeguspinnatifidaBge.的干燥成熟果實(shí)。味酸、甘，性微溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，具有消食健胃、行氣散瘀、化濁降脂的功能，用于肉食積滯、胃脘脹滿、瀉痢腹痛、瘀血經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀阻、心腹刺痛、胸痹心痛、疝氣疼痛、高脂血癥等[1]。山楂化學(xué)成分主要為有機(jī)酸[2-4]、黃酮[2]、三萜[3]等成分。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明山楂有強(qiáng)心、降血壓、降血脂、增加冠狀動(dòng)脈流量、抗腫瘤等作用[5]。目前山楂的質(zhì)量研究包括黃酮及有機(jī)酸含量測(cè)定[6-7]，亦有指紋圖譜研究報(bào)道[8-10]。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化色譜條件，建立了山楂HPLC指紋圖譜，為山楂質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HP1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，二極管陣列檢測(cè)器(美國Agilent公司)。

1.2 材料

10批山楂來源見表1，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)魏剛研究員鑒定為薔薇科植物山里紅CrataeguspinnatifidaBge.var.majorN.E.Br.的干燥成熟果實(shí)；綠原酸對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-200413)；乙腈(德國Merk公司)為色譜純；其他試劑為分析純；水為純化水。

表1 10批山楂樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用ZORBAX SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相確定為乙腈(A)-1%乙酸溶液(B)，梯度洗脫：0～15 min，A為11%→14%；15～25 min，A為14%→16%；25～35 min，A為16%→20%；35～60 min，A為20%→29%；檢測(cè)波長為238 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為5～10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取本品粉末(過四號(hào)篩)1.0 g，精密稱定，精密加入甲醇25 mL，稱重，超聲處理50 min，取出，放冷，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓⑥D(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

取綠原酸對(duì)照品精密稱定，加甲醇制成每1 mL含綠原酸70 μg的對(duì)照品溶液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果所測(cè)的指紋圖譜與所得的共有模式的相似度均大于0.99，表明精密度良好，符合指紋圖譜研究要求。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別在0、3、6、12、24 h 進(jìn)樣，結(jié)果所測(cè)的指紋圖譜與所得的共有模式的相似度均大于0.99，表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性較好，符合指紋圖譜研究要求。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，依法制備5份供試品溶液并進(jìn)樣分析，結(jié)果所測(cè)的指紋圖譜與所得的共有模式的相似度均大于0.99，表明重復(fù)性良好，符合指紋圖譜研究要求。

2.5 指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 共有峰的確定、鑒定及參照峰的選擇 按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣分析，10批樣品均標(biāo)出12個(gè)共有峰。采用國家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(2004A版)，以均值法分別生成10批樣品指紋圖譜共有模式，10批樣品重疊圖譜及共有模式見圖1、圖2。經(jīng)對(duì)照品及紫外光譜對(duì)照，峰2為綠原酸。12個(gè)峰的紫外光譜見圖3。選擇峰6為參照峰(S)，分別計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積，結(jié)果見表2。

圖1 10批山楂HPLC指紋圖譜重疊圖

圖2 山楂HPLC指紋圖譜共有模式

2.5.2 相似度分析 采用國家藥典委相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件，以均值法分別生成10批樣品指紋圖譜共有模式，以共有模式為對(duì)照分析10批樣品相似度，結(jié)果見表3，提示市售山楂質(zhì)量相對(duì)較穩(wěn)定。

圖3 山楂HPLC指紋圖譜主要特征峰紫外光譜

表2 10批山楂HPLC指紋圖譜特征峰分析結(jié)果

表3 10批山楂HPLC指紋圖譜相似度

3 討論

湯樹良等[8]采用355 nm、彭燦等[9]采用325 nm、羅文等[10]采用280 nm為檢測(cè)波長進(jìn)行分析。本研究通過不同檢測(cè)波長(238、254、280、325、340、355 nm)進(jìn)行篩選比較，發(fā)現(xiàn)一類特征峰(如峰1、峰4～9、峰11)在280 nm附近有最大吸收，但總體吸收較小；而采用238 nm為檢測(cè)波長，峰面積明顯加大，其他類型特征峰也能兼顧，因此確定了238 nm的方法。同時(shí)進(jìn)行了不同色譜柱(Kromasil 100-5 C18、ZOBAX SB Aq、ZORBAX SB C18)、不同流動(dòng)相系統(tǒng)(乙腈-0.1%磷酸、乙腈-1%乙酸、乙腈-0.1%甲酸)、酸水濃度(0.5%，1%，2%乙酸)、流速(0.8、1.0、1.2 mL·min-1)、不同柱溫(30、35、40 ℃)等色譜條件的篩選優(yōu)化，主要特征峰分離度相對(duì)較好。通過對(duì)提取溶媒(70%甲醇、85%甲醇、甲醇)、提取次數(shù)(超聲處理1次、2次)、提取超聲處理時(shí)間(40、50、60 min)、生藥質(zhì)量濃度(0.5、1.0、2.0 g·mL-1)等進(jìn)行篩選，確定了供試品溶液制備方法。

通過分析10批山楂藥材的HPLC指紋圖譜，建立了山楂藥材HPLC指紋圖譜共有模式，共標(biāo)示出12個(gè)共有峰；不同批次的山楂藥材指紋圖譜相似度相對(duì)較高(大于0.96)，說明市售山楂的質(zhì)量相對(duì)較穩(wěn)定。本研究建立的HPLC指紋圖譜方法穩(wěn)定、重復(fù)性好，可為評(píng)價(jià)山楂藥材的質(zhì)量提供方法依據(jù)。

經(jīng)對(duì)照品及紫外光譜對(duì)照，鑒別了峰2為綠原酸，相對(duì)峰面積較高。根據(jù)光譜分析，峰10、峰12為黃酮類成分，但相對(duì)峰面積不是很高，說明山楂的黃酮類成分含量相對(duì)較低。而峰1、峰4～ 9、峰11的紫外光譜基本一致，屬于山楂的一類特征成分，其成分鑒別有待進(jìn)一步研究。

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StudyonHPLCFingerprintofCrataeguspinnatifida

LONG Feng1，XIEZhenshan2，GAOXinkai1，HUANGYuechun3，CAOZifeng1，WEIGang2*

[1.Infinitus(China)Co.，Ltd.，Jiangmen529156，China；2.GuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510006，China；3.ThefirstAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510405，China]

Objective：To optimize the HPLC method for fingerprint analysis onCrataeguspinnatifidaby HPLC.Methods：HPLC was performed with the ZORBAX SB C18，the acetonitrile-1% acetic acid solution(gradient elution)was employed as a mobile phase，detection wavelength was 238 nm，column temperature was 35 ℃，and flow rate was 1.0 mL·min-1.The similarity was evaluated on the similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of traditional Chinese medicine.Results：12 common peaks were separated from 10 batches ofC.pinnatifida.The similarities of 10 batches were 0.964-0.995，which indicated that the quality ofC.pinnatifidawas relatively stable.Conclusion：The method is accurate and reproducible，which can be used for the quality control ofC.pinnatifida.

Crataeguspinnatifida；fingerprint；HPLC

2016-03-02)

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魏剛，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥新藥研究與指紋圖譜分析，Tel：(020)39358166，E-mail：weigang021@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.014