酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子的化感作用研究△

龍期良，李勇，高原，丁萬(wàn)隆

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子的化感作用研究△

龍期良，李勇，高原，丁萬(wàn)隆*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京100193)

目的：研究7種常見(jiàn)酚酸類化感物質(zhì)對(duì)人參種子萌發(fā)的影響。方法：采用浸種培養(yǎng)的方法，用含250、25、2.5、0.25mg·L-1酚酸類物質(zhì)的水溶液在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)人參種子，7d后測(cè)量人參種子胚根和胚軸長(zhǎng)度，研究酚酸類化合物對(duì)人參種子萌發(fā)的自毒效應(yīng)；另外，借助體視顯微鏡觀察酚酸脅迫對(duì)萌芽人參種子胚根形態(tài)的影響。結(jié)果：酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子胚根和胚軸的化感作用強(qiáng)度與化合物種類及酚酸濃度密切相關(guān)。低濃度酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子的胚根和胚軸的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用，高濃度酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子的胚根和胚軸的生長(zhǎng)起抑制作用。此外研究還發(fā)現(xiàn)，酚酸類物質(zhì)對(duì)人參根尖的形態(tài)和根毛的生長(zhǎng)也有不同程度影響。結(jié)論：酚酸類物質(zhì)對(duì)人參正常生長(zhǎng)及人參根尖顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)均具有化感作用。

酚酸；人參；種子；自毒作用

人參PanaxginsengC.A.Meyer為五加科人參屬植物，為我國(guó)特有的名貴中藥材。人參忌地性極強(qiáng)，栽過(guò)一茬后的土壤幾十年內(nèi)無(wú)法重復(fù)栽參。人參的連作障礙已成為人參產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要制約因素之一。已有研究表明，導(dǎo)致人參連作障礙的原因除了土壤理化性質(zhì)劣變，病原微生物累積外，自毒作用也是導(dǎo)致人參連作障礙出現(xiàn)的一個(gè)主要因素[1]。酚酸類物質(zhì)是植物生命活動(dòng)中產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物。近年來(lái)，酚酸類物質(zhì)作為一類主要的植物化感物質(zhì)受到廣泛關(guān)注[2]。在人參連作障礙研究過(guò)程中，雷鋒杰等[3]研究證實(shí)人參根際分泌物中含有對(duì)人參具有自毒作用的化感物質(zhì)。吳立潔等[4]從三七根際土壤中檢測(cè)到了苯甲酸等6種酚酸類物質(zhì)。高微微等[5]從西洋參根際土壤中檢測(cè)到了香草酸等酚酸類化感自毒物質(zhì)。李勇等[6]從人參根際土壤中分離并鑒定了苯甲酸等化感物質(zhì)。越來(lái)越多證據(jù)表明，化感自毒效應(yīng)與自毒物質(zhì)種類及濃度呈現(xiàn)明顯相關(guān)性，不同種類化感物質(zhì)對(duì)人參的自毒作用強(qiáng)度存在明顯差異[7-9]。本實(shí)驗(yàn)選取了從老參地分離并鑒定的7種酚酸類化感物質(zhì)[5-6]，研究了其對(duì)人參種子生長(zhǎng)及人參根尖顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，從而為闡明酚酸類化感物質(zhì)在人參連作障礙中的自毒作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

經(jīng)過(guò)后熟的人參種子于2015年4月采自吉林省撫松縣人參種植基地。人參種子先用自來(lái)水沖洗干凈，再用1000倍的50%多菌靈可濕性粉劑處理15min，自來(lái)水反復(fù)沖洗多次，在25℃恒溫保濕培養(yǎng)2d，從中選擇發(fā)芽整齊、顆粒飽滿的種子開(kāi)展自毒效應(yīng)研究。

供試藥劑：(A)苯甲酸；(B)肉桂酸；(C)阿魏酸；(D)水楊酸；(E)香草酸；(F)對(duì)羥基苯甲酸；(G)香蘭素均為分析純，購(gòu)于北京化學(xué)試劑有限公司。

1.2方法

分別稱取1g(A)苯甲酸、(B)肉桂酸、(C)阿魏酸、(D)水楊酸、(E)香草酸、(F)對(duì)羥基苯甲酸、(G)香蘭素，溶于4mL無(wú)水乙醇中，配制成250mg·mL-1母液，根據(jù)本課題組測(cè)定的人參根際土壤中酚酸類物質(zhì)的含量[6]以及高微微等[5]測(cè)定的老參地中酚酸類物質(zhì)的含量，用蒸餾水將母液稀釋成250、25、2.5、0.25mg·L-1工作液備用。

采用玻璃培養(yǎng)皿法，在Φ9cm的玻璃培養(yǎng)皿底部鋪兩層滅菌濾紙，分別加入5mL上述工作液，均勻擺放10粒滅菌處理的人參種子，以加蒸餾水為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。種子在培養(yǎng)箱中避光保濕培養(yǎng)，7d后，參考黃小芳等[7]人參化感自毒作用的研究方法，用直尺測(cè)量人參種子胚根長(zhǎng)和胚軸長(zhǎng)。在LeicaS8APO型體視顯微鏡下，AnymicroDSSYT-7M型顯微數(shù)碼攝影儀系統(tǒng)10倍放大視野下觀察人參幼根根尖形態(tài)。

1.3數(shù)據(jù)分析

參照Williamson等[10]的方法采用化感效應(yīng)指數(shù)(RI)表示化感自毒作用強(qiáng)弱，其中RI=(T1-T0/T0)(T1為實(shí)驗(yàn)組測(cè)量值，T0為對(duì)照組測(cè)量值)。當(dāng)RI>0為促進(jìn)效應(yīng)，RI<0為抑制效應(yīng)。利用化感綜合效應(yīng)指數(shù)(SE)表示化感自毒作用的綜合效應(yīng)，SE為同種處理下人參種子胚根和胚軸長(zhǎng)的化感效應(yīng)指數(shù)RI的平均值[11]。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0和One-way ANOVA單因子方差分析，結(jié)合LSD-Test法對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果在0.05水平下進(jìn)行差異顯著性分析，確定處理組和對(duì)照組之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子胚根生長(zhǎng)的影響

如表1所示，低濃度酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子胚根的生長(zhǎng)主要起促進(jìn)作用，高濃度則起抑制作用。在0.25mg·L-1濃度下，B、D和E組人參種子胚根的生長(zhǎng)與對(duì)照組相比具有顯著差異(P<0.05)，而A、C、F和G組人參種子胚根的生長(zhǎng)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。在2.5mg·L-1濃度下，A、D、E、F和G組人參種子胚根的生長(zhǎng)與對(duì)照組相比具有顯著差異(P<0.05)，而B(niǎo)和C組人參種子胚根的生長(zhǎng)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。當(dāng)濃度超過(guò)25mg·L-1時(shí)，7種酚酸類物質(zhì)處理下的人參種子胚根的生長(zhǎng)與對(duì)照組相比均具有顯著差異(P<0.05)。

表1 酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子胚根生長(zhǎng)的影響

注：同列中不同字母表示處理間在P<0.05水平存在差異顯著，下同。

如圖1所示，不同酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子胚根生長(zhǎng)的自毒效應(yīng)不同，同種酚酸對(duì)人參種子胚根生長(zhǎng)的自毒作用強(qiáng)度與濃度有密切的關(guān)系。當(dāng)濃度為0.25 mg·L-1時(shí)，B、C、D、E、F、G的RI>0，表明這些物質(zhì)在0.25 mg·L-1濃度下對(duì)人參種子胚根的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用，其中B、D、F的化感效應(yīng)指數(shù)與對(duì)照組相比具有顯著差異(P<0.05)。而A的RI<0，表明A在0.25 mg·L-1濃度下，對(duì)人參種子胚根的生長(zhǎng)起抑制作用，但其化感效應(yīng)指數(shù)與對(duì)照相比無(wú)顯著差異。當(dāng)濃度為2.5mg·L-1時(shí)，A、B、C、D、E、F、G的RI<0，表明這些物質(zhì)在2.5 mg·L-1時(shí)，對(duì)人參種子胚根的生長(zhǎng)均起抑制作用，其中A、D、E、F、G的化感效應(yīng)指數(shù)與對(duì)照相比具有顯著差異RI<0。當(dāng)濃度≥25 mg·L-1時(shí)，7種物質(zhì)的化感效應(yīng)指數(shù)與對(duì)照相比均具有顯著差異(P<0.05)。

*表示處理組與對(duì)照組的自毒效應(yīng)指數(shù)差異顯著(P<0.05)，下同。圖1 酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子胚根的自毒效應(yīng)

如圖2所示，酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子胚根生長(zhǎng)的影響還表現(xiàn)在根尖形態(tài)上。當(dāng)濃度為25 mg·L-1時(shí)，根尖頂端部分開(kāi)始出現(xiàn)彎曲或變小。當(dāng)濃度為250 mg·L-1時(shí)，根尖部分的根毛減少，根尖出現(xiàn)損傷或腐爛。

圖2 酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子根尖形態(tài)的影響(根尖長(zhǎng)約5 mm)

2.2酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子胚軸生長(zhǎng)的影響

如表2所示，酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子胚軸生長(zhǎng)的影響也主要表現(xiàn)為，低濃度起促進(jìn)作用，高濃度則起抑制作用。在0.25mg·L-1濃度處理下，B、C、D、E、F組人參種子胚軸的生長(zhǎng)與對(duì)照組相比具有顯著差異(p<0.05)，而A和G組人參種子胚軸的生長(zhǎng)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。在2.5mg·L-1濃度處理下，B、C、D和G組人參種子胚軸的生長(zhǎng)與對(duì)照相比具有顯著差異(P<0.05)，而A、E、F組人參種子胚軸的生長(zhǎng)與對(duì)照組無(wú)顯著差異。當(dāng)濃度≥25mg·L-1時(shí)，7種酚酸類物質(zhì)處理下的人參種子胚軸的生長(zhǎng)與對(duì)照組相比均具有顯著差異。

表2 酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子胚軸生長(zhǎng)的影響

如圖3所示，B、C和F組在濃度≤2.5 mg·L-1時(shí)，其RI>0，表明B、C和F在濃度低于2.5 mg·L-1時(shí)，對(duì)人參種子胚軸的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用，其中B和C組的化感效應(yīng)指數(shù)與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，而F組只在濃度低于0.25 mg·L-1時(shí)，其化感效應(yīng)指數(shù)與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)。A、D、E和G組在濃度為0.25 mg·L-1時(shí)，其RI>0，表明A、D、E和G在濃度為0.25 mg·L-1時(shí)，對(duì)人參種子胚軸的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用，其中E組的化感效應(yīng)指數(shù)與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)。A、D、E和G組在濃度為2.5 mg·L-1時(shí)，其RI<0，表明A、D、E和G在濃度為2.5 mg·L-1時(shí)，對(duì)人參種子胚軸的生長(zhǎng)起抑制作用，其中G組的化感效應(yīng)指數(shù)與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)。當(dāng)濃度≥25 mg·L-1時(shí)，7種酚酸類物質(zhì)的RI<0，表明這7種物質(zhì)在濃度大于25 mg·L-1時(shí)，對(duì)人參種子胚軸的生長(zhǎng)起抑制作用，而且其化感效應(yīng)指數(shù)與對(duì)照相比均具有顯著差異(P<0.05)。

圖3 酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子胚軸的化感自毒效應(yīng)

2.3酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子生長(zhǎng)的化感綜合效應(yīng)

如表3所示，7種酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子的化感綜合效應(yīng)總體表現(xiàn)為低促高抑。在0.25mg·L-1濃度處理下，7種酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用，隨濃度增加，促進(jìn)作用逐漸降低或轉(zhuǎn)為抑制作用。當(dāng)濃度≥25mg·L-1時(shí)，7種酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子的生長(zhǎng)均表現(xiàn)為抑制作用，而各酚酸類物質(zhì)的化感綜合效應(yīng)的強(qiáng)弱順序隨著濃度的變化而變化。當(dāng)濃度為25mg·L-1時(shí)，各酚酸類物質(zhì)的化感綜合效應(yīng)指數(shù)大小順序?yàn)椋篋>B>E>C>A>F>G，而當(dāng)濃度為250mg·L-1時(shí)，各酚酸類物質(zhì)的化感綜合效應(yīng)指數(shù)大小順序?yàn)椋篍>F>D>G>C>B>A。

表3 酚酸類物質(zhì)對(duì)人參種子生長(zhǎng)的化感綜合效應(yīng)指數(shù)

3 討論

連作條件下，藥用植物隨栽培年限增加，根系分泌的自毒物質(zhì)逐漸積累，當(dāng)濃度足夠高時(shí)，就會(huì)影響植株正常生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響，進(jìn)而引發(fā)連作障礙[12]。連作障礙長(zhǎng)期困擾人參種植產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，該問(wèn)題的產(chǎn)生是人參-土壤-微生物等因素綜合作用的結(jié)果[1]。化感自毒作用是導(dǎo)致人參連作障礙的主要原因之一，根際分泌物中的酚酸類化合物在植物自毒作用和連作障礙中具有重要的作用[13-14]。李勇等[6]從人參的根際土壤中分離并鑒定了苯甲酸等酚酸類物質(zhì)。張愛(ài)華等[15]從人參的根際分泌物中鑒定出了酚酸類化合物。本實(shí)驗(yàn)選取了包括苯甲酸在內(nèi)的7種常見(jiàn)酚酸類化合物，證實(shí)了這些酚酸類化合物對(duì)人參種子的生長(zhǎng)均具有化感自毒作用，其化感作用規(guī)律總體表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)人參種子的生長(zhǎng)，高濃度抑制人參種子的生長(zhǎng)。并且，在此基礎(chǔ)上明確了人參對(duì)酚酸類物質(zhì)化感作用的耐受閾值濃度在2.5×10-4-2.5×10-3g·L-1之間。高微微等[5]研究證實(shí)西洋參對(duì)酚酸類物質(zhì)化感作用的耐受閾值在9×10-4-1.1×10-3g·L-1之間，與本研究結(jié)果基本一致。這表明，人參和西洋參對(duì)酚酸類物質(zhì)化感自毒作用的敏感性上具有一致性。楊家學(xué)等[16]研究證實(shí)小麥、玉米、水稻等農(nóng)作物對(duì)酚酸類物質(zhì)的耐受閾值在5×10-3-2.5×10-2g·L-1之間。這表明農(nóng)作物對(duì)酚酸類物質(zhì)的耐受閾值高于人參和西洋參，這為參糧輪作的實(shí)施提供了直接的理論依據(jù)。

研究還發(fā)現(xiàn)，不同酚酸類物質(zhì)對(duì)人參胚根和胚軸的生長(zhǎng)存在差異，而且不同濃度下各酚酸類物質(zhì)的化感綜合效應(yīng)指數(shù)的強(qiáng)度順序也存在差異，筆者推測(cè)這可能是不同酚酸類物質(zhì)在人參細(xì)胞中的作用機(jī)理存在差異或是人參對(duì)不同酚酸類物質(zhì)的敏感程度不同。不同酚酸類物質(zhì)的作用潛力及其化感自毒作用機(jī)理還有待今后深入研究，以便為人參連作障礙的消除提供新思路。

植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)與周圍的環(huán)境總是相適應(yīng)的，逆境環(huán)境影響植物生長(zhǎng)，并可引起植物形態(tài)結(jié)構(gòu)的相應(yīng)變化[17]。植物形態(tài)和生長(zhǎng)方面對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)都比較直觀，了解植物受環(huán)境脅迫后形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，可為植物的受損機(jī)理以及抗逆研究提供直觀的證據(jù)[18]，許世泉等研究了人參根際土壤提取物對(duì)人參根尖組織結(jié)構(gòu)的影響，證實(shí)了人參化感物質(zhì)能破壞人參根尖的組織結(jié)構(gòu)，從而抑制人參的正常生長(zhǎng)。這與本文的研究結(jié)果一致，此外，本研究還發(fā)現(xiàn)酚酸會(huì)影響人參根毛的正常生長(zhǎng)。根毛是植物根部表皮細(xì)胞上的一些頂端封閉的管狀突起，是植物根系功能區(qū)段生理活性界面的重要組成部分[19]。這表明影響根毛的生長(zhǎng)可能是酚酸類物質(zhì)對(duì)人參化感作用的主要作用方式之一，但其作用機(jī)理還有待研究。

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AllelopathyofPhenolicCompoundsonPanaxginsengSeeds

LONGQiliang，LIYong，GAOYuan，DINGWanlong*

Objective：To research the allelopathic effects of seven phenolic compounds onPanaxginsengseeds.Methods：TheP.ginsengseeds were cultivated on petri dish with0.25，2.5，25，250mg·L-1phenolic solution，the lengths of radicle and plumule of ginseng seeds were examined seven days later.Furthermore，the effects of phenolic on morphology of radicle of ginseng seeds were observed by stereomicroscope.Results：The allelopathic potential of phenolic on radicle and plumule of ginseng seeds were closely related to the species and concentrations of phenolic compounds.The growth of radicle and plumule of ginseng seeds were promoted at low concentrations of phenolic，but it was inhibited at high concentrations of phenolic.Moreover，this study found that the phenolic could influence the morphology of radicle and the growth of root hair.Conclusion：Phenolic compounds had allelopathy on the growth ofP.gisengand micromorphology of radicle.

Phenolic；PanaxGinseng；Seed；Autotoxicity

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China)

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.1.012

2015-12-12)

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81072992；81373911)；中藥材種子種苗和種植(養(yǎng)殖)標(biāo)準(zhǔn)平臺(tái)(2012ZX09304006)

*

丁萬(wàn)隆，研究員，研究方向：藥用植物栽培及病害防治；E-Mail：wlding@implad.ac.cn