側(cè)柏葉烏發(fā)活性成分探究△

高旦，劉葉，惠小維，包海鷹

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118)

側(cè)柏葉烏發(fā)活性成分探究△

高旦，劉葉，惠小維，包海鷹*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118)

目的：研究側(cè)柏葉CacluneuPlatycladi的主要化學(xué)成分對酪氨酸酶活性的影響，從而確定側(cè)柏葉烏發(fā)作用的有效組分。方法：通過提取得到側(cè)柏葉所含的揮發(fā)油、總黃酮、鞣質(zhì)以及樹脂，采用蘑菇酪氨酸酶速率氧化法體外測定酪氨酸酶活性。結(jié)果：揮發(fā)油、鞣質(zhì)均表現(xiàn)為輕度的抑制作用，而總黃酮?jiǎng)t表現(xiàn)較強(qiáng)的抑制作用，樹脂表現(xiàn)出較強(qiáng)的激活作用。結(jié)論：側(cè)柏葉中具有烏發(fā)作用的活性組分可能是樹脂。

側(cè)柏葉；側(cè)柏葉化學(xué)成分；酪氨酸酶活性

側(cè)柏葉(Platycladi cacumen)又名叢柏葉，是側(cè)柏的干燥嫩枝梢及葉。中醫(yī)認(rèn)為側(cè)柏葉氣清香，味苦澀，性寒，歸肺、肝、脾經(jīng)。具有涼血止血、化痰止咳，生發(fā)烏發(fā)之功。用于吐血，魈血，咯血，便血，崩漏下血，肺熱咳嗽，血熱脫發(fā)，須發(fā)早白[1]。

明代李時(shí)珍《本草綱目》中記載側(cè)柏葉“乃多壽之木，所以可以入服食。道家以之點(diǎn)湯常飲。”側(cè)柏葉作為傳統(tǒng)的中藥，其烏發(fā)功能一直被人忽略。而在諸多古代文獻(xiàn)中記載其主要功能為烏發(fā)和生發(fā)，在《本草綱目》中謂其：浸油，生發(fā)，燒汁，黑發(fā)。和豬脂，沐發(fā)長黑。然而側(cè)柏葉烏發(fā)的機(jī)理尚不明確[2]。

白發(fā)的病因與發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，可能與遺傳、衰老、疾病等導(dǎo)致的黑素干細(xì)胞衰老、黑素細(xì)胞減少等有關(guān)，機(jī)制包括bcl-2基因缺失、氧化損傷、氧化應(yīng)激、微量元素缺乏等。其中，酪氨酸酶(tyrosinase)表達(dá)量減少或活性降低是一個(gè)重要的因素[3-4]。酪氨酸酶是體內(nèi)黑素合成的主要限速酶，酪氨酸酶活性降低將使體內(nèi)黑素合成的反應(yīng)進(jìn)行得十分緩慢[5]。目前研究表明，側(cè)柏葉主要含有黃酮、揮發(fā)油、鞣質(zhì)、樹脂、微量元素等化學(xué)成分[2]，本實(shí)驗(yàn)選側(cè)柏葉的主要化學(xué)成分進(jìn)行研究，考察側(cè)柏葉是否通過某種化學(xué)成分直接激活酪氨酸酶的催化活性而促進(jìn)黑色素的形成，為進(jìn)一步研究側(cè)柏葉的烏發(fā)機(jī)理提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥品

側(cè)柏葉購自山東省濟(jì)寧市側(cè)柏種植基地，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院包海鷹教授鑒定為側(cè)柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥枝梢和葉。

1.2 試劑

蘑菇酪氨酸酶(tyrosinase)、L-多巴(L-Dopa)均購自美國Sigma公司；磷酸酶氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙醇、石油醚、乙酸乙酯均為分析純。

1.3 儀器

721型分光光度計(jì)(上海第三儀器分析廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 磷酸緩沖溶液(PBS)的配制

稱取0.2 mol·mL-1磷酸二氫鈉溶液250 mL，加0.2 mol·mL-1的氫氧化鈉溶液118 mL，用水稀釋至1000 mL，定容，即得。

2.2 酪氨酸酶溶液的配制

稱取13.28 g(25 KU)蘑菇酪氨酸酶(1881 U·mg-1)，用PBS定容至25 mL，即1 KU·mL-1，分裝-20 ℃保存，臨用時(shí)室溫平衡，即得，稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度143 U·mL-1。

2.3 L-多巴溶液的配制

精密稱取197.19 mg L-多巴，用PBS溶液定容至100 mL，須現(xiàn)用現(xiàn)配，濃度為197.19 g·mol-1。

2.4 側(cè)柏葉中總黃酮的提取

稱取側(cè)柏葉2.5 kg，用65%乙醇回流提取2次，提取時(shí)間1.5 h，每次料液比1∶15，合并提取液，離心取上清液，濃縮干燥得浸膏，在室溫下干燥，備用。取部分干燥后的乙醇提取物，加一定量的蒸餾水稀釋，依次用石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，在室溫下干燥，備用。稱取部分乙酸乙酯萃取物，用10%乙醇溶解，離心(3000 r·min-1)，用AB-8大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，得到的純化產(chǎn)物置于干燥器中保存?zhèn)溆茫礊閭?cè)柏葉中的總黃酮。

2.5 側(cè)柏葉中揮發(fā)油的提取

稱取新鮮的側(cè)柏葉2.5 kg，用石油醚(30～60 ℃)進(jìn)行回流提取，提取時(shí)間3 h，料液比1∶12.5，合并提取液濃縮，干燥。取干燥后的適量提取物，放入揮發(fā)油提取器中，用水蒸氣蒸餾法進(jìn)行提取，得黃色透明液體1.2 g。

2.6 側(cè)柏葉中樹脂的提取

按照上述揮發(fā)油的提取工藝，提取揮發(fā)油后剩余的提取液，干燥濃縮，即為側(cè)柏葉中的樹脂成分。

2.7 側(cè)柏葉中鞣質(zhì)的提取

稱取新鮮的側(cè)柏葉2.5 kg，用65%的含水丙酮在室溫下高速攪碎機(jī)內(nèi)破碎成勻漿狀，甩濾，反復(fù)操作3次，合并濾液，減壓濃縮，得到粗的總鞣質(zhì)。

2.8側(cè)柏葉中主要化學(xué)成分對酪氨酸酶活性的影響

將上述提取所得到的主要化學(xué)成分用適量二甲基亞砜溶解，然后用PBS定容，制成濃度分別為10、20、30 mg·mL-1的3個(gè)濃度梯度。以L-多巴溶液為底物，在3 mL的PBS的測活體系中，先加入0.1 mL不同濃度的提取物于比色杯中，再加入2.8 mL預(yù)先在37 ℃恒溫水浴保溫的底物溶液，然后加入0.1 mL蘑菇酪氨酸酶溶液，立刻混勻，在37 ℃恒溫條件下測定波長為475 nm的吸光度值[6]。

根據(jù)在475 nm下的吸光度值，計(jì)算側(cè)柏葉的主要化學(xué)成分對酪氨酸酶的激活率(%)，并將酶活性激活率(%)達(dá)到50%時(shí)激活劑的濃度測定為IC50值。同時(shí)以不加樣品的測活體系為空白對照。激活率(%)可以根據(jù)下式進(jìn)行：

激活率=[(C-D)-(A-B)]/(A-B)

其中：A=A475-藥+酶；B=A475-藥-酶；

C=A475+藥+酶；D=A475+藥-酶

2.9 數(shù)據(jù)分析

側(cè)柏葉中揮發(fā)油、總黃酮、總鞣質(zhì)、樹脂對酪氨酸酶活性的影響見表1～4。

表1 側(cè)柏葉中揮發(fā)油對酪氨酸酶活性的影響

表2 側(cè)柏葉中總黃酮對酪氨酸酶活性的影響

表3 側(cè)柏葉中總鞣質(zhì)對酪氨酸酶活性的影響

表4 側(cè)柏葉中樹脂對酪氨酸酶活性的影響

由表1可知，側(cè)柏葉中的揮發(fā)油對酪氨酸酶有輕度的抑制作用，并且抑制作用隨著濃度增大有逐漸增大的趨勢。

由表2可知，側(cè)柏葉中的總黃酮對酪氨酸酶有顯著抑制作用，并且在藥物濃度達(dá)到30 mg·mL-1時(shí)，抑制率達(dá)113.34%，與陳興芬報(bào)道的側(cè)柏葉中總黃酮對酪氨酸酶的抑制作用隨黃酮濃度的增大而增大基本一致[2]。由表3可知，側(cè)柏葉中的鞣質(zhì)對酪氨酸酶也有輕度的抑制作用。由表4可知，側(cè)柏葉中的樹脂對酪氨酸酶有顯著的激活作用，在藥物濃度達(dá)到30 mg·mL-1時(shí)，激活率達(dá)102.13%，這與《本草綱目》中“浸油，生發(fā)，燒汁，黑發(fā)。和豬脂，沐發(fā)長黑”的記載不謀而合。

3 討論

側(cè)柏葉中的樹脂類成分對酪氨酸酶有顯著的激活作用，可能是側(cè)柏葉一直作為烏發(fā)中藥的活性成分，但其活性單體成分有待進(jìn)一步探究。

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：215-216.

[2] 陳興芬.側(cè)柏葉化學(xué)成分提取及活性功能研究[D].南京：南京師范大學(xué)，2011.

[3] 付慶霞,王海蘋.白發(fā)病因與發(fā)病機(jī)理研究現(xiàn)狀[J].光明中醫(yī),2009,24(2):375-377.

[4] Ken I，Takahiro A，Nguyen TB，et al.Genotoxic；stress abrogates renewalolMelanoc；yte stem cells by triggering their differentiation[J].CeLL，2009，137：1088-1099

[5] Prota G.Progress in the chemistry of melanin and related metabolites[J].Med Re s Rev，1988，8：525-556.

[6] HanamuraT，UchinaE，Aoki H.Skinlightening effect of a polyphenol extract from acerola(malpighiaemarginata DC.)fruit on UV-induced pigmentation[J].BiosciBiochem，2008，72(12)：3211-3218.

StudiesonCharacteristicofHairBlackingIngredientinCacumenPlaycladi

GAO Dan，LIUYe，HUIXiaowei，BAOHaiying*

(CollegeofChineseMedicinalMaterials，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China)

Objective：To study the main chemical compositions of Cacumen Platycladieffect on tyrosinase activity，so as to determine the Cacumen Platycladiufa role of effective component.Methods：Volatile oil，flavonoids，tannins and resin were extracted from Cacumen Platycladiis，tyrosinase activity was measured by the rate of mushroom tyrosinase oxidation methodinvitro.Results：The volatile oil，the tannins were characterized by mild inhibitory effect，and inhibition of flavonoids was stronger，resin showed stimulating effect.Conclusion：The hair blacking role of Cacumen Platycladi，may be due to the resin.

Cacumen Platycladi；chemical compositions of Cacumen Platycladi；activity of tyrosinase

2015-09-24)

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金(20150320)

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包海鷹，教授，研究方向：中藥學(xué)；E-mail：baohaiying2008@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.014