Box-Behnken響應曲面法篩選金銀花中抗流感病毒活性成分研究△

邱玲玲，肖瑩，支星，袁淑琴，馬寧，王建芬*

(1.長沙醫學院 藥學院，湖南 長沙 410000；2.九江職業大學 護理學院，江西 九江 332900)

·基礎研究·

Box-Behnken響應曲面法篩選金銀花中抗流感病毒活性成分研究△

邱玲玲1，2，肖瑩2，支星2，袁淑琴2，馬寧1，王建芬1*

(1.長沙醫學院 藥學院，湖南 長沙 410000；2.九江職業大學 護理學院，江西 九江 332900)

目的：辨識金銀花中抗流感病毒活性成分，并探討各活性成分間的相互作用關系與優化配比。方法：以流感病毒神經氨酸酶活性抑制率為表征，采用Box-Behnken響應曲面法進行設計研究。結果：發現金銀花中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸-A具較明顯抗病毒活性，相互關系研究表明綠原酸與隱綠原酸之間存在拮抗作用，新綠原酸對其他組分具有協同作用；經模型預測及驗證得到優化配比為新綠原酸-綠原酸-隱綠原酸-異綠原酸-A(10 μg·mL-1∶21.028 μg·mL-1∶216.85 μg·mL-1∶52.88 μg·mL-1)，較金銀花作用更強。結論：實驗結果可為新型抗流感病毒活性神經氨酸酶抑制劑研究提供參考。

抗流感病毒；響應曲面法；金銀花；活性成分；神經氨酸酶抑制劑

從流感病毒H1N1的流行到現今H7N9出現，流感病毒已造成了對人類健康的重大危害，對社會和諧穩定和世界經濟發展構成了巨大威脅[1]，如何有效防治流感病毒是全球醫藥研發的重大課題和巨大挑戰。中藥在預防和治療流感的實踐中積累了豐富的臨床經驗，中藥及其復方也因其“多組分、多靶點、多效應、不易耐藥”的特點在流感治療中發揮著日益重要的作用[2]。金銀花為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或初開的花，具清熱解毒、疏散風寒的功效，已廣泛應用于抗流感病毒、抗菌的臨床治療中，療效確切，且藥效物質相對明確[3]。本研究以抗流感病毒活性神經氨酸酶(neuraminidase，NA)抑制率為指標，采用Box-Behnken響應曲面法(BBD)進行設計研究，辨識金銀花的抗病毒活性成分，以明確主要及相關藥效成分，探討各成分間相互作用關系，預測抗病毒優化配比，以期為金銀花組分中藥的篩選提供研究基礎，為新型NA抑制劑研究做好鋪墊。

1 材料與儀器

1.1 藥材與試劑

綠原酸(批號：FY14351025)、新綠原酸(批號：FY14380315)、隱綠原酸(批號：FY14390310)、異綠原酸-A(批號：FY14400329)、棕櫚酸(批號：FY18491202)、灰氈毛忍冬皂苷乙(批號：FY13290912)、咖啡酸(批號：FY13810623) 、木犀草素(批號：FY14650427)、藥材金銀花(JYH)(為忍冬花蕾，產自山東臨沂平邑)等均購于南通飛宇生物科技有限公司；流感病毒NA(批號：SLBM0746V)(來源于產氣莢膜梭菌)和MUNANA (批號：SLBM6111V)均購于sigma公司；磷酸奧斯他韋酸顆粒(Ostw，宜昌東陽陽光長江藥業股份有限公司)；甘氨酸、氯化鈣(西隴化工股份有限公司)。

1.2 儀器

Spectra Max M4熒光酶標檢測儀(美國Molecular Devices公司)；恒溫細胞培養箱；96孔熒光酶標板(美國Costar公司)。

2 方法

采用經典的的熒光酶標法[4]，以NA抑制率(I%)為指標進行研究。

反應抑制率(I%)=[(酶活性對照熒光-底物空白組熒光)-(樣品測試組熒光-樣品背景組熒光)]/(酶活性對照熒光-底物空白組熒光)×100%

(1)

3 結果與討論

3.1 金銀花抗流感病毒活性成分的辨識

采用單因素考察法考察金銀花中各單體成分對NA活性的抑制作用。研究對象包括金銀花主要成分[5-6]：新綠原酸(A)、綠原酸(B)、隱綠原酸(C)、異綠原酸-A(D)、棕櫚酸(E)、灰氈毛忍冬皂苷乙(F)、咖啡酸(G)及木犀草素(H)，并以磷酸奧斯他韋酸為陽性藥進行對照比較。研究發現E、F、G和H未表現出較明顯的NA抑制作用；而A、B、C和D 4個化合物表現出較為明顯的NA抑制活性，且在一定濃度范圍內呈明確的量效關系(見圖1)。因此初步認為這4個化合物可作為金銀花抗流感病毒活性成分。

注：JYH代表金銀花水提物，相當于金銀花藥材的質量濃度，單位為g·mL-1。圖1 單因素法考察金銀花中各成分對NA活性抑制作用結果

3.2 金銀花抗流感病毒活性成分優化配比預測與評估

通過對金銀花抗流感病毒主要活性成分篩選的研究，采用BBD法對抗流感病毒活性較強的A、B、C和D 4個成分在低、中、高3個濃度水平(依次標記為-1、0、+1)進行優化研究，共計29次實驗，因素水平見表1，實驗設計及結果見圖2。

表1 基于BBD法的金銀花抗流感病毒成分因素水平表

圖2 基于BBD法的金銀花抗流感病毒成分篩選實驗設計及結果

用Design-Expert軟件對上述29次BBD實驗數據進行多元線性回歸分析，建立金銀花活性成分A、B、C和D與NA抑制率I%關系的數學模型，所得多元線性回歸方程為：

I%=71.371 1-7.162 5×A+12.063 3×B+13.209 2×C+1.930 0×D+7.430 0×AB+5.412×AC+2.320 0×AD-13.620 0×BC-1.610 0×CD-4.862 4×B2-8.141 2×C2-4.464 9×D2

(2)

經方差分析和顯著性檢驗，各因素對抑制率I%值的貢獻率差異較大(見表2)。

表2 方差分析和顯著性檢驗結果

注：*P<0.05；**P<0.01。

據F值大小提示這4個成分對NA抑制作用強弱依次為C>B>A>D，且A、B和C對NA抑制率I%值的影響具有統計學意義(P<0.01)，相比而言D雖然對NA抑制作用表現為不顯著，其中B和C均與I%值表現為正相關，公式(2)顯示兩者聯合使用時表現為BC的系數為負數，推測B和C之間表現為相互拮抗的關系，聯合使用應注意比例協調，減弱拮抗作用；A與I%值雖表現為負相關，但A分別與B、C及D聯用時系數卻為正數，尤其是與組分AB對NA的抑制率較為顯著(P<0.05)，推測A為成分B 、C 、D的協同增效成分。組分CD與I%值表現為負相關，認為C和D之間可能存在拮抗減效作用。

根據上述模型方程，一階偏導求解方程得到金銀花抗流感病毒活性組分的最優配比(ZJPB)為新綠原酸-綠原酸-隱綠原酸-異綠原酸-A(10μg·mL-1∶21.028 μg·mL-1∶216.85 μg·mL-1∶52.88 μg·mL-1)，模型預測其NA抑制率為82.57%，按預測的最佳配比驗證得到實際NA抑制率為84.64%，與模型預測值僅相差2.07%，將最優配比與各成分單獨抑制NA比較，以金銀花為參照(以綠原酸含量計算)，結果如圖3所示。結果表明最優配比抑制作用較4個單體成分單獨使用抑制作用的總和更強，說明組分間成分發揮協同增效作用。與金銀花相比，最佳配比的抑制作用更強。

圖3 單體成分及最佳配比抑制NA作用比較

目前用于流感病毒治療的藥物雖較多，但隨著流感病毒的變異以及耐藥毒菌的出現，許多藥物即將或是已經被淘汰[7-8]，因此新的抗流感病毒藥物的研發已經非常迫切，抗流感病毒篩選的方法也被廣泛應用。現用于抗流感病毒篩選的方法主要有體內和體外實驗法[9-11]，如MTT比色法，紅細胞凝集活性檢測法，流感病毒感染的小鼠肺炎模型實驗法。熒光酶標法是流感病毒NA活性體外檢測常用方法之一。由于NA是影響流感病毒復制、感染和致病的關鍵酶，NA抑制劑已經成為抗流感病毒的一線藥物，因此近年來該法已發展為抗流感病毒藥物的篩選和活性評價的重要方法[12-13]。

BBD法具有普篩高效、預測準確等優勢[14-15]，適合用于快速發現中藥活性成分研究和組分中藥的初步探索。本研究基于BBD法，在藥效活性系統表征的基礎上篩選得到的藥效組分，成分清晰、機制明確，為流感疫情的防治及NA抑制劑的新制劑研究提供參考，為有效推進現代組分中藥的發展提供技術支持。契于組分中藥多組分、多環節、多靶點作用特點，對抗流感病毒各關鍵靶點深入體內、外試驗以確認初篩的活性成分將是后續研究工作的重心所在。

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ScreeningActiveIngredientsofLoniceraeJaponicaeFlosagainstInfluenzaBasedonBox-BehnkenResponseSurfaceMethod

QIULingling1，2，XIAOYing2，ZHIXing2，YUANShuqin2，MANing1，WANGJianfen1*

(1.Collegeofpharmacy，ChangshaMedicalUniversity，Changsha410219，China；2.CollegeofNursing，JiujiangVocationalUniversity，Jiujiang332000，China)

Objective：This study aimed to screen active ingredients of Lonicerae Japonicae Flos dry flower buds against influenza，so that the interaction relationship between the active ingredient could be objectively assessed and the proportioning ratio could be optimized.Methods：The antiviral effect on neuraminidase activity of influenza virus was applied as the evaluating indicator and Box-Behnken response surface methodology was used in the experiment.Results：The results indicated that chlorogenic acid，cryptochlorogenic acid，isochlorogenic acid-A and neochlorogenic acid were the main active ingredients of Lonicerae Japonicae Flos.Antagonistic action existed between chlorogenic acid and cryptochlorogenic acid，whereas synergistic action between neochlorogenic acid and other ingredients.By dynamic simulation and verification，the optimum proportioning ratio was as follows：neochloroge-nic acid：chlorogenic：acid-cryptochlorogenic acid：isochlorogenic acid-A (10μg·mL-1∶21.028 μg·mL-1∶216.85 μg·mL-1∶52.88 μg·mL-1)，which is stronger than that of Lonicerae Japonicae Flos.Conclusion：The results was reliable，which could provide foundation for the research of new type NA inhibitors.

Anti-influenza virus；response surface methodology；Lonicerae Japonicae Flos；active ingredients；neuraminidase inhibitors

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.11.014

2016-04-17)

湖南省教育廳科學研究項目(13C1130)

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王建芬，講師，研究方向：中藥分析；E-mail：qlfcsj@163.com