革葉山姜葉揮發油GC-MS分析及活性研究△

開亮，蔡月，付艷輝，宋小平，陳光英，韓長日

(1.海南師范大學 熱帶藥用植物化學教育部重點實驗室，海南 海口 571158；2.海南師范大學 化學與化工學院，海南 海口 571158)

革葉山姜葉揮發油GC-MS分析及活性研究△

開亮1，2，蔡月1，付艷輝1，宋小平1，陳光英1，韓長日

(1.海南師范大學 熱帶藥用植物化學教育部重點實驗室，海南 海口 571158；2.海南師范大學 化學與化工學院，海南 海口 571158)

目的：分析研究革葉山姜葉揮發油的主要成分及其抗腫瘤活性。方法：采取水蒸氣蒸餾法從革葉山姜葉中提取揮發油，利用GC-MS對其化學成分進行分析。采用MTT法檢測革葉山姜葉揮發油對細胞Hela、A549的增殖抑制作用。結果：共分離出39個峰，鑒定出31個化學成分，占揮發油總量的94.81%。其主要成分為芳樟醇(34.91%)、橙花叔醇(18.23%)和桉葉油醇(14.48%)。抑制腫瘤細胞增殖的活性結果表明革葉山姜葉揮發油對2種腫瘤細胞株均有一定的抑制活性，其中對人肺腺癌細胞A549的抑制活性相對較好，其IC50值為14.01 μg·mL-1。結論：該實驗為革葉山姜的進一步開發研究提供可靠的科學依據。

革葉山姜；揮發油；GC-MS；抗腫瘤活性

山姜屬(AlpiniaL.)系姜科植物，總共約有250多種，主要分布在亞熱帶地區，在我國約有46種，產于東南部至西南部[1]。山姜屬植物具有很高的藥用價值，其性味辛溫，具有保護胃黏膜、鎮痛、抗腫瘤、抗氧化、抗應激等藥理活性，臨床上主要用于脾胃寒證[2]。該屬植物紅豆蔻、草豆蔻、益智、高良姜均被《中國人民共和國藥典》收錄[3]。山姜屬植物的揮發性成分研究主要集中在高良姜、大高良姜、草豆蔻、紅豆蔻、艷山姜等植物，對其他山姜屬植物的研究較少[4]。革葉山姜Alpiniacoriacea為姜科山姜屬植物，是海南特有植物，截至目前未見任何關于革葉山姜的揮發油成分及其藥理活性報道。本課題組前期研究中發現革葉山姜的乙醇提取物具有顯著的抗人類免疫缺陷病毒(HIV)活性，為了合理開發利用革葉山姜這一海南特有植物資源，本課題組首次對革葉山姜揮發油成分進行了系統研究。本實驗通過水蒸氣蒸餾法提取革葉山姜新鮮葉中的揮發油成分，采用氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)對革葉山姜葉揮發油進行成分分析，經計算機質譜數據系統檢索，面積歸一化法確定各成分的質量分數。同時進行抑制腫瘤細胞增殖的活性測試，為革葉山姜藥用價值的進一步開發利用提供理論依據。

1 材料與儀器

革葉山姜全草于2014年5月采自海南省昌江霸王嶺國家森林公園，經中國醫學科學院藥用植物研究所海南分所李蓉濤研究員鑒定為姜科山姜屬植物革葉山姜Alpiniacoriacea的全草，憑證標本(No.H20140502)保存于海南師范大學熱帶藥用植物化學教育部重點實驗室標本室。

Agilent 5975B/6890N型氣相色譜-質譜聯用儀(美國安捷倫公司)，Elx800 型酶標儀(美國寶特公司)，揮發油專用提取裝置。實驗所用試劑均為市售分析純試劑，水為蒸餾水。供試腫瘤細胞：人宮頸癌Hela細胞、人肺腺癌A549細胞(中國科學院上海生物研究所)。

2 方法

2.1 揮發油的提取

將新鮮的革葉山姜葉粉碎，取100 g加水浸泡，使用水蒸氣蒸餾法[5]提取4 h，再用無水乙醚萃取，得到淡黃色透明油狀物。

2.2 分析條件

進樣條件：樣品瓶溫度為100 ℃，定量環(1.0 mL)溫度為110 ℃，傳輸線溫度為120 ℃，氣相平衡時間為5.5 min，樣品平衡時間為7.0 min，樣品瓶加壓時間為0.1 min，定量環增量時間為0.5 min，樣品環平衡時間為0.05 min，進樣時間為1.0 min。

GC條件：石英毛細管柱HP-FFAP(30 m×250 μm，0.25 μm)，初始溫度為50 ℃，保持 1 min，以5 ℃·min-1速率升溫，升溫到200 ℃保持5 min，再以8 ℃·min-1升溫速率升溫到280 ℃保持至完成分析，載氣為氦氣(99.99%)，柱流量為1.0 mL·min-1，進樣口溫度為250 ℃，分流比為 50∶1。

MS條件：電離方式為EI電離源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，溶劑延遲為2.5 min，全掃描(Scan)采集模式，質量范圍m/z50～550，掃描間隔0.50 s，EM電壓1400 V。

2.3 抑制腫瘤細胞增殖活性測試

用含10%胎牛血清的培養液(DMEM)配成單個細胞懸液，以每孔5000個細胞接種到96孔板，每孔體積100 μL，貼壁細胞提前12 h接種培養。加100 μL待測樣，設定加6孔，以40 μg·mL-1質量濃度為初篩濃度，根據初篩結果設定5個梯度濃度進行復篩，每種設定3個平行復孔。37 ℃培養48 h后，每孔加四甲偶氮唑鹽(MTT)溶液20 μL。繼續孵育4 h，終止培養，吸棄孔內培養上清液，每孔加150 μL的DMSO溶液，使結晶物充分融解。在酶標儀(BioTek ELx800)490 nm讀取各孔吸光度值并記錄結果，計算揮發油的最大半數抑制濃度(IC50)值[6]。

3 結果

3.1 揮發油成分分析

通過上述實驗方法制取革葉山姜揮發油，得到具有特殊香味淡黃色透明油狀物1.7 g，提取率為1.7%。按上述的GC-MS條件對革葉山姜葉的揮發油進行分析，GC分離出39個組分，根據面積歸一化法從總離子流圖(見圖1)中計算各組分百分含量，通過質譜數據庫Nist08檢索，鑒定了31個化學成分，結果見表1。相對質量分數較高的成分為芳樟醇(34.91%)、橙花叔醇(18.23%)和桉葉油醇(14.48%)、合金歡醇(5.62%)等。

圖1 革葉山姜葉揮發油總離子流圖

表1 革葉山姜葉揮發油成分分析

3.2 揮發油抑制腫瘤細胞增殖活性

采用MTT比色法對揮發油進行抑制腫瘤細胞增殖活性的研究，結果見表2。其對人肺腺癌A549細胞抑制活性相對較好，IC50值為14.01 μg·mL-1，而對人宮頸癌Hela細胞具有中等強度的抑制活性，IC50值為25.69 μg·mL-1。

表2 革葉山姜葉揮發油抑制腫瘤細胞增生活性

4 討論

對革葉山姜揮發油成分經過GC-MS鑒定分析出了31個化合物，占總含量的94.81%，主要成分為醇類、烯烴類等化合物。革葉山姜葉揮發油中含有多種活性成分，如α-石竹烯可強烈誘導小鼠肝和小腸中的解毒酶谷胱苷肽S-轉移酶活性而對化學致癌起抑制作用[7]，陳偉強課題組研究表明α-蒎烯對肝癌BEL-7402細胞的生長有抑制作用[8]。

抑制腫瘤細胞的增殖活性測試結果表明，革葉山姜葉揮發油對人宮頸癌Hela細胞和人肺腺癌A549細胞有抑制活性。這為進一步研究革葉山姜的藥用價值提供了理論依據。

[1] 中國科學院《中國植物志》編輯委員會.中國植物志：第16卷[M].北京：科學出版社，2005：67.

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[3] 亓淑芬，姚慶強.山姜屬植物化學成分及藥理活性的研究進展[J].齊魯藥事，2009，28(5)：284-287.

[4] 劉磊，秦華珍，王曉倩，等.10味山姜屬藥物揮發油成分的氣相-質譜聯用分析[J].廣西植物，2012，32(4)：561-566.

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GC-MSAnalysisandBioactivityofEssentialOilfromLeavesofAlpiniacoriacea

KAI Liang1，2，CAIYue1，FUYanhui1，SONGXiaoping1，CHENGuangying1，2，HANChangri1，2*

(1.KeyLaboratoryofTropicalMedicinalPlantChemistryofMinistryofEducation；HainanNormalUniversity，Haikou571158，China；2.CollegeofChemistryandChemicalEngineering，HainanNormalUniversity，Haikou571158，China)

Objective：To study the chemical constituents and bioactivity of essential oil from the leaves ofAlpiniacoriacea.Methods：The essential oil was extracted by water vapor distillation and analyzed by GC-MS.The inhibitory activity of essential oil on Hela and A549 cell proliferation was assayed using the MTT.Results：GC-MS result showed that there were 39 peaks and 31 compounds were identified，which weighed 94.81% of the essential oil.The major components were linalool(34.91%)，nerolidol(18.23%)and eucalyptol(14.48%).Antitumor activity results showed that has a certain inhibitory activity，including on lung adenocarcinoma A549 cells better inhibitory activity，its IC50value of 14.01 μg·mL-1.Conclusion：The experiment forA.coriaceaprovides reliable scientific basis for further research.

Alpiniacoriacea；essential oil；GC-MS；inhibitory activity

2016-03-21)

國家國際科技合作專項(ISTCP)(2014DFA40850)；國家自然科學基金(81360478，21362009，81160391)

*

韓長日，教授，博士生導師，研究方向：天然藥物化學；Tel：(0898)65889422，E-mail：hchr116@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.009