肺抑瘤膏對EGFR野生型Lewis肺癌小鼠腫瘤生長及LC3表達的影響

鄭心，彭召云,，孟憲志，莊賀

1.山東中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，山東濟南 250001；2.山東中醫(yī)藥大學，山東濟南 250014

肺抑瘤膏對EGFR野生型Lewis肺癌小鼠腫瘤生長及LC3表達的影響

鄭心1，彭召云1,2，孟憲志1，莊賀2

1.山東中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，山東濟南 250001；2.山東中醫(yī)藥大學，山東濟南 250014

目的 建立Lewis肺腺癌小鼠移植瘤模型，取移植瘤進行EGFR基因測序，觀察肺抑瘤膏對移植瘤的干預作用。方法 使用C57BL/6小鼠，接種Lewis肺腺癌細胞，造模成功后，隨機分4組，生理鹽水對照組（組Ⅰ）、肺抑瘤膏組（組Ⅱ），3-MA組（組Ⅲ），Rap組（組Ⅳ），藥物干預后，觀察瘤重，并進行電鏡、Western Blot檢測及EGFR基因測序。結(jié)果 EGFR基因測序示：非突變型。肺抑瘤膏可以明顯減輕移植瘤瘤重，組Ⅱ與生理鹽水對照組瘤重比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），組Ⅱ抑瘤率為25.22%；以自噬抑制劑3-MA、自噬誘導劑Rap作為對照分析，肺抑瘤膏組與3-MA組在瘤重、LC3/β-actin相對表達量兩方面比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而與Rap組在瘤重、LC3/β-actin相對表達量兩方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。電鏡提示肺抑瘤膏可影響腫瘤細胞自噬。結(jié)論 肺抑瘤膏能夠明顯抑制EGFR非基因突變型肺腺癌移植瘤的生長，且可能通過影響腫瘤細胞自噬起到治療作用。

肺抑瘤膏；Lewis肺癌；EGFR非基因突變型；LC3

原發(fā)性支氣管肺癌現(xiàn)居全球癌癥首位[1]，其中，肺腺癌占肺癌發(fā)病率的25%左右[2]，其確診時絕大多數(shù)已屬中晚期，化療耐藥、放療抵抗等問題的存在[3-4]，應用單一治療方法均難以獲得滿意療效，EGFR非基因突變型肺腺癌靶向治療效果差[5]，目前臨床治療迫切需要安全、有效的綜合治療方案，中藥抗EGFR非基因突變型肺腺癌的研究有重要臨床意義。該實驗通過觀察肺抑瘤膏干預EGFR非基因突變型小鼠肺腺癌移植瘤模型，應用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）、自噬誘導劑雷帕霉素(Rap)作為對照，探討在細胞自噬方面抑制EGFR非基因突變型肺腺癌發(fā)生發(fā)展的作用機制。

1 臨床資料

1.1 實驗動物及條件

C57BL/6近交系雄性小鼠 [（合格證號 SCXK(魯) 20140007）]，6～8周齡，體重（18±2）g，購于山東省實驗中心。接種了Lewis鼠源肺腺癌細胞株的小鼠，購于國家實驗細胞資源共享平臺。于SPF級動物房常規(guī)飼養(yǎng)至適應環(huán)境后，進行造模。

1.2 主要實驗試劑及藥物

Taq DNA聚合酶、DNA分子量Marker，測序試劑：ABI BigDye3.1。BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、預染Marker、SDS-PAGE電泳液、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、PVDF膜、內(nèi)參、內(nèi)參二抗等。微管相關(guān)蛋白1輕鏈LC3抗體（CST）。戊二醛固定液。0.9%氯化鈉注射液，雷帕霉素（Rap，稀釋為0.85 mg/mL）（北京華邁科），3-甲基腺嘌呤（3-MA，稀釋為1.5 mg/mL），肺抑瘤膏（膏方含生藥量約4.3 g）由山東中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥劑科提供[（灌胃0.2 mL/（次·d），相當于70 kg成人按體表面積折算的等效劑量）]。

2 實驗方法

2.1 造模方法

頸椎脫臼法處死1只腫瘤生長良好的Lewis肺腺癌荷瘤小鼠，在超凈工作臺上用無菌鑷子、剪刀完整剝離腫瘤組織，于冰上制備細胞懸濁液，低溫離心、計數(shù)后調(diào)整細胞濃度為1.0 mL×107 mL，兩人合作在小鼠腋窩下接種腫瘤細胞懸液0.2 mL/只（約含瘤細胞2.0×106個）[6]。

2.2 分組及給藥

接種腫瘤細胞后，每日觀察小鼠腋下移植瘤情況，當能摸到米粒大小瘤體時，說明瘤細胞接種成功。按照SPSS統(tǒng)計軟件隨機設立生理鹽水對照組（組Ⅰ）、肺抑瘤膏干預組（組Ⅱ），3-MA組（組Ⅲ），Rap組（組Ⅳ），10只/組。分組后開始藥物干預。組Ⅰ予生理鹽水灌胃0.2 mL/（次·d）。組Ⅱ予肺抑瘤膏灌胃0.2 mL/（次·d）。組Ⅲ予提前稀釋分裝的3-MA，0.2 mL/次，腹腔注射，2次/周。組Ⅳ予提前稀釋分裝的Rap，0.2 mL/次，腹腔注射，2次/周。

2.3 觀察指標及方法

①瘤重、抑瘤率：末次灌胃24 h后稱重處死小鼠，快速剝離瘤體，稱瘤重，計算各組腫瘤抑制率。腫瘤抑制率=（生理鹽水對照組平均瘤重-用藥組平均瘤重）/生理鹽水對照組平均瘤重×100%

②電鏡檢測：剝離瘤體后，把標本塊修整成符合要求的顆粒（≤0.5 mm），以最快的速度（最多 2 min），浸入戊二醛固定液，送檢。

③LC檢測：免疫印跡法檢測移植瘤中自噬特異蛋白LC蛋白表達。

④EGFR檢測：組Ⅰ、組Ⅱ小鼠移植瘤進行EGFR基因（18、19、20、21號外顯子）毛細管電泳測序。

2.4 統(tǒng)計方法

采用 SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件分析所有數(shù)據(jù)，采用均數(shù)±標準差(±s)形式表示計量資料，行t檢驗；[n（%）]表示計數(shù)資料，行χ2檢驗，其中 P＜0.05，說明差異有統(tǒng)計學意義，P＞0.05，說明差異無統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 一般情況

隨移植瘤的生長，各組小鼠的活動逐漸減少，精神萎靡，毛發(fā)無光澤易脫落，攻擊性明顯降低，進食、飲水減少，組Ⅲ小鼠表現(xiàn)最明顯。

3.2 種植成功率

接種Lewis細胞后一周內(nèi)所有小鼠腋下均可觸及移植瘤，瘤體積均可達一定大小(約100～150 mm3)，成瘤率100%，造模成功率100%。

3.3 瘤重、抑瘤率

組Ⅱ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ抑瘤率分別為25.22%、1.37%、32.55%、瘤變具體見表1。

表1 小鼠移植瘤的瘤重[(±s)，g]

表1 小鼠移植瘤的瘤重[(±s)，g]

注：各組間瘤重比較：與組Ⅰ比較，▲P＜0.05；與組Ⅱ比較，☆P＜0.05。與組Ⅲ比較，△P＜0.05；與組Ⅳ比較，□P＜0.05。

組別 瘤重組Ⅰ（n=10）組Ⅱ（n=10）組Ⅲ（n=10）組Ⅳ（n=10）（8.05±0.36）☆□（6.02±0.40）▲△（7.94±0.28）☆□（5.43±0.5）5▲△

3.4 透射電鏡

透射電鏡提示：肺抑瘤膏可影響腫瘤細胞自噬，見圖1。

圖1 各組透射電鏡圖片（8000×）

3.5 Western blot結(jié)果

LC3、β-actin表達量，見圖2，圖3。

圖2 LC3、β-actin蛋白條帶

圖3 LC3/β-actin相對表達量柱狀圖

圖3各組間LC3/β-actin相對表達量比較：生理鹽水對照組與3-MA組比較P=0.888，與肺抑瘤膏組比較P= 0.014，與Rap組比較P=0.004。肺抑瘤膏組與3-MA組比較P=0.019，與Rap組比較P=0.544。3-MA組與Rap組比較P=0.005。

3.6 EGFR基因毛細管電泳測序結(jié)果

（1）基因組DNA與PCR擴增產(chǎn)物，見圖4、圖5。

作業(yè)成本法的采用不只是管理層和財務部門實施的結(jié)果，作業(yè)成本法需要企業(yè)全員參加和支持。這是一個復雜的系統(tǒng)國產(chǎn)，其數(shù)據(jù)來源于企業(yè)基層，來源于每個員工的工作，作業(yè)成本法的推進和改革，需要企業(yè)各個部門的配合。

圖4 樣品基因組DNA電泳圖

圖5 PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

（2）項目總結(jié)：20個樣品的18，19，20，21號外顯子均測序合格。①其中20號外顯子含poly A和poly G結(jié)果，已經(jīng)進行加測反應；②比對結(jié)果顯示無明顯突變。

4 討論

導師以中醫(yī)辯證論治為指導，結(jié)多年臨床經(jīng)驗擬定了肺抑瘤膏方，首次把中醫(yī)膏方引入肺癌的臨床與實驗研究。方中以黨參、黃芪為君補益肺脾之氣；白術(shù)祛濕助脾氣健運、茯苓滲濕健脾、麥冬養(yǎng)陰生津潤肺清心、女貞子滋補肝腎共為臣藥。佐以浙貝、夏枯草、山慈菇清熱散結(jié)，薏苡仁滲濕健脾，貫眾清熱涼血，莪術(shù)破血行氣、消積止痛，蜂房攻毒破積。生甘草清熱解毒，調(diào)和諸藥為使。本方諸藥合用，組方嚴謹，扶正而不斂邪，祛邪而不傷正，氣血同治，寒熱平調(diào)，平補陰陽，無耗氣傷陰之弊。整體體現(xiàn)了扶正祛邪、動靜結(jié)合、攻補兼施的配伍特點。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)晚期肺癌患者應用肺抑瘤膏，可有效控制原發(fā)腫瘤病灶，減輕化療引起的不良反應，提高患者的生存質(zhì)量，延長患者生存期。且膏劑有口感好、劑型小、服用量少、便于攜帶、易于耐受等優(yōu)點，充分體現(xiàn)了中藥簡、便、廉、驗的特點。前期動物實驗從抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、提高機體免疫功能等多環(huán)節(jié)入手進行了一系列研究，但對腫瘤細胞自噬的研究尚屬首次。

自噬是溶酶體對細胞內(nèi)的部分細胞質(zhì)、細胞器等進行一系列降解過程的統(tǒng)稱。許多研究發(fā)現(xiàn)自噬可以在抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用，如通過誘發(fā)腫瘤細胞發(fā)生程序性死亡，從而抑制細胞生長[7-9]。對自噬的分析一般是對組織切片標本進行電鏡觀察和 LC3蛋白的檢測[10]。自噬檢測的金標準是自噬性結(jié)構(gòu)的電鏡下形態(tài)學觀察，透射電子顯微鏡是觀察自噬現(xiàn)象的最直接、最經(jīng)典的方法。最常用的檢測自噬標志物LC3蛋白表達的方法是蛋白印跡法。

該次實驗通過EGFR基因測序，證實Lewis肺腺癌EGFR基因為非基因突變型。通過肺抑瘤膏組與生理鹽水對照組比較，發(fā)現(xiàn)肺抑瘤膏組在減輕小鼠腋下移植瘤瘤重、提高腫瘤抑制率方面均明顯優(yōu)于生理鹽水對照組，提示肺抑瘤膏對EGFR非基因突變型肺腺癌移植瘤原發(fā)病灶有明顯的抑制作用，能有效抑制其瘤體生長，降低移植瘤的生長率。以自噬抑制劑3-MA、自噬誘導劑Rap作為對照分析：電鏡結(jié)果示應用自噬抑制劑3-MA后，自噬小泡數(shù)量較生理鹽水對照組明顯減少，應用自噬誘導劑Rap后，自噬小泡數(shù)量較生理鹽水對照組明顯增加，與文獻描述一致。應用肺抑瘤膏干預后，自噬小泡數(shù)量亦較生理鹽水對照組明顯增加，說明肺抑瘤膏可影響腫瘤細胞自噬。蛋白的Western blot結(jié)果示3-MA可明顯抑制自噬標志物LC3蛋白表達，Rap可誘導自噬蛋白LC3的表達，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.005），與文獻中描述一致。肺抑瘤膏組與3-MA組在瘤重、LC3/β-actin相對表達量兩方面比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與Rap組在瘤重、LC3/β-actin相對表達量兩方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。說明肺抑瘤膏能明顯抑制EGFR非基因突變型肺腺癌移植瘤生長，增加自噬標志蛋白LC3表達，結(jié)合電鏡結(jié)果，推測肺抑瘤膏可能是通過誘導腫瘤細胞自噬而發(fā)揮治療作用的，為進一步研究其作用機制提供了證據(jù)及思路。

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Expression of LC3 throug Anti-lung Tumor Ointment in Lewis Lung Model Mice of EGFR Non Genetic Mutations

ZHENG Xin1，PENG Zhao-yun1，2，MENG Xian-zhi1，ZHUANG He2
1.Second Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan,Shandong Proivnce,250001;2.Shandong U-niversity of Traditional Chinese Medicine,Jinan,Shandong Proivnce 250014 China

Objective Through the establishment of Lewis lung tumor model in mice,the transplanted tumors were detected EGFR gene sequencing and Anti-lung Tumor Ointment were observed the intervention effect for transplanted tumors.Methods The C57BL/6 mice were inoculated with Lewis lung carcinoma cells to established of Lewis lung tumor model.The mice were randomly divided into four groups after successful modeling.Normal saline group (group I),Anti-lung Tumor Ointment group(group II),3-MA group(group III),Rap group(group IV).We observed the tumor weight and the electron microscope,and Western Blot,and EGFR gene sequencing.Results EGFR gene sequencing shows:Non-mutant.Anti-lung Tumor Ointment can significantly reduce the tumor weight.GroupⅡcompared with groupⅠin tumor weight,expression were different(P＜0.05).Group II tumor suppressor rate was 25.22%.GroupⅡcompared with group III in tumor weight and LC3/β-actin relative expression,expression were different(P＜0.05).GroupⅡcompared with group IV in tumor weight and LC3/β-actin relative expression,expression were no different(P＞0.05).Electron microscopy result show that Anti-lung Tumor Ointment can affect autophagy.Conclusion Anti-lung Tumor Ointment can significantly inhibit transplanted tumor growth of EGFR non genetic mutations of lung adenocarcinoma in lewis lung model mice,and may play a therapeutic rolethrough the induction of autophagy.

Anti-lung Tumor Ointment;Lewis lung carcinoma;EGFR non genetic mutations;LC3

R73；R28

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2016.02.03.07

2016-07-20；

2016-08-18

鄭心（1964.1-），女，山東濟南人，博士，主任醫(yī)師，主要從事肺癌及肺間質(zhì)病的中西醫(yī)結(jié)合診斷與治療研究工作。