大豆疫霉病拮抗內生真菌的鑒定與篩選

劉永政，邊 爽，孫立杰，宋佳宇，董 慧，張玉琦，趙靜博，肖佳雷

(東北農業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030)

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大豆疫霉病拮抗內生真菌的鑒定與篩選

劉永政，邊 爽，孫立杰，宋佳宇，董 慧，張玉琦，趙靜博，肖佳雷*

(東北農業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030)

[目的]篩選出拮抗致病大豆疫霉的真菌菌株，為深入研發生物菌劑提供依據。[方法]采用平板對峙法測定40 株野生大豆真菌對疫霉菌的抑制作用。[結果]供試的40 株菌株，不同菌株間菌落型態差異較大。從光滑程度分析，36份菌落表面不光滑，3份表面光滑并顯淺黃色；從菌落顏色分析，正面以白色為主，其次是黃色和粉色；反面則以紫色為主，其次為黑色和綠色；從菌落生長型態分析，大多數菌落呈白色絮狀突起或羊毛狀菌絲；11株野生大豆內生真菌的抑菌率變化幅度為62%～81%，80%以上共1株Y4-S(Ⅰ)，75%～80%共2株，70%～75%共3株，其余5株均低于70%。抑菌率從大到小依次為Y4-S(Ⅰ)、Y5-r(Ⅱ)-1、Y6R-15-1、Y1-r-3和Y5R4、Y6S-26、Y5LB、Y5r-12、Y2-5(Ⅱ)、Y2-S、Y5R18-2-1。 [結論]最強拮抗菌株Y4-S(Ⅰ)、Y5-r(Ⅱ)-1、Y6R-15-1顯微型態相似，呈枝狀，有隔，初步判斷可能來源同一屬，具體屬種需要進一步判斷。

大豆疫霉病；野生大豆；內生真菌；拮抗菌株

大豆疫霉根腐病是嚴重影響世界大豆生產的毀滅性病害之一[1-2]。該病害危害面積大，毀滅性強，每年使大豆減產10%左右，且嚴重降低大豆的品質[3]。目前，由于大豆疫霉具有很高的小種變異性，單一抗性品種的有效期短，對大豆疫霉根腐病的危害不能達到較高的防治效果；化學防治殺菌劑不能對所有的小種有效，農藥殘留大、污染環境；各種栽培措施雖可減輕損失但不能完全控制該病害[4]。采用微生物菌劑，研發生物農藥的生物防治則是目前解決大豆疫霉病的重要措施。野生大豆內生真菌相對于栽培大豆附生內生真菌具有更穩定的生存環境，具有豐富的抗逆資源，因此，把拮抗性野生大豆內生真菌作為生防菌及外源基因載體更易于發揮作用，創造出新的可利資源[5-6]。鑒于此，筆者選用原生境野生大豆中分離的40株內生真菌，采用平板對峙法進行了大豆疫霉病的拮抗內生真菌菌株鑒定與篩選，以期為研發生物菌劑提供重要的內生真菌資源。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株。 大豆疫霉病菌為生理1號小種，由東北農業大學大豆研究所提供；野生大豆內生真菌40株，由東北農業大學生命科學學院植物生物工程研究室提供，主要分布黑龍江省不同區、市及縣，菌株名稱及來源見表1。

1.1.2培養基。PDA培養基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。將土豆去皮切成小塊，用蒸餾水煮沸30 min，經紗布過濾，收集濾液，將稱量好的蔗糖加入，用攪拌器攪拌均勻，加入定量的稀釋好的含有蔗糖的土豆汁，121 ℃、0.1 kPa滅菌20 min。

加富 PDA培養基：馬鈴薯塊 200 g，葡萄糖 10 g，牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，氯化鈉5 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。

1.2方法

1.2.1菌株活化。將得到的內生真菌接種到PDA平板培養基上，于26 ℃下培養，24 h后開始不斷觀察直到有明顯的菌落形態，及時進行照片記錄和菌落形態描述(包括菌落顏色、菌絲形態等一系列特征)。真菌菌落外觀形態特征采集采用日本佳能 60D相機(18～200 mm IS)，技術參數為：APS-C規格數碼單反，1 800萬有效像素，10倍光學變焦。

1.2.2對峙試驗。采用平板對峙法檢測野生大豆內生真菌對病原真菌的拮抗效果。第1步，篩選對病原真菌有拮抗作用的菌株，挑取內生真菌菌絲接種于平板中央，然后將4種不同的致病真菌接種于四周，28 ℃黑暗培養5 d。觀察有無拮抗作用。第2步，檢測具有拮抗作用的內生真菌對病原真菌作用的強弱，挑取病原真菌接種于中央，內生真菌接種于兩側，28 ℃黑暗培養5 d后測量抑菌圈大小[7]。

表1　野生大豆內生真菌名稱及來源

1.2.3指標測定。

1.2.3.1抑菌圈直徑。在對峙法中形成明顯抑菌現象后，測量兩菌落中心連線上病原菌的菌落直徑，求各重復的平均值，以此評價拮抗菌對各個被測菌的抑菌效果。

1.2.3.2拮抗菌株直徑。垂直于大豆內生真菌中心連線上的病原菌落直徑，求各重復的平均值，以此作為對照病原菌的菌落直徑。

1.2.3.3抑菌率。拮抗真菌對于病原菌的拮抗程度。抑菌率=(對照病原菌的菌落直徑-處理病原菌的菌落直徑) /對照病原菌的菌落直徑[8]。

1.2.4顯微觀察。 將挑選出的具有拮抗效果的內生真菌進行繼代培養。接種活化的對應內生真菌到PDA平板上，26 ℃下培養3～4 d，將滅過菌的載玻片斜插入到已活化菌株平板的培養基上，26 ℃下培養48 h，讓菌絲自然爬到載玻片上后取出載玻片進行顯微觀察。應用正立生物顯微鏡Axioskop 2 plus FL(德國蔡司公司)，在40倍放大倍數下觀察菌絲形態。

2　結果與分析

2.1不同內生真菌菌落特征表2統計分析表明，不同菌株間菌落型態差異較大。從光滑程度分析，40份材料中有36份菌落表面不光滑，3份表面光滑并顯淺黃色，1份污染；從菌落顏色分析，正面以白色為主，其次為黃、粉色；反面則以紫色為主，其次為黑、綠色；從菌落生長型態分析，大多數菌落呈白色絮狀突起或羊毛狀菌絲。菌株Y2-L(Ⅲ)和y6s-8表面分泌淺黃色蠟狀物質，疑是油，具體成分待定。

表2　不同菌株菌落型態特征統計

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續表2

2.2大豆疫霉病拮抗內生真菌菌株鑒定與篩選將40株已活化的內生真菌分別接種了單對排布的對峙培養基，共有11種表現出了對大豆疫霉的拮抗作用。表3表明，11株野生大豆內生真菌的抑菌率變化幅度為62%～81%，80%以上共1株Y4-S(Ⅰ)，75%～80%共2株，70%～75%共3株，其余5株均低于70%。抑菌率從大到小依次為Y4-S(Ⅰ)、Y5-r(Ⅱ)-1、Y6R-15-1、Y1-r-3和Y5R4、Y6S-26、Y5LB、Y5r-12、Y2-5(Ⅱ)、Y2-S、Y5R18-2-1。從來源地分析，牡丹江寧安縣野生大豆內生真菌具有拮抗功能的菌株較多，其次為同江市和遜克縣，進一步表明黑龍江省大豆主產區的野生大豆具有較好的抗大豆疫霉病作用。

2.3拮抗菌株的菌落特征及顯微觀察圖1表明，3株具有拮抗作用野生大豆內生真菌不僅來源地不同，而且來自于野生大豆的不同器官。Y4-S(Ⅰ)菌株分離器官為葉片，菌落正面不光滑，為淺紫色絨毛狀，反面中央為深紫色，向周圍放射性生長，顏色逐漸變淺；Y5-r(Ⅱ)-1菌株分離器官根，表面不光滑，菌絲為棉花狀，正面為白色，反面為乳白色；Y6R-15-1分離器官莖，表面不光滑，有白色針狀突起，正面為白色，反面為紫紅色，培養基為紫色。顯微結構分析，3株拮抗內生真菌的型態相似，呈枝狀、有隔，初步判斷可能來源統一屬，具體屬種需要進一步判斷。

表3　拮抗菌株的相關測量數據

圖1　拮抗菌株型態和顯微結構特征(40×)Fig.1　Morphology and microstructure of antagonistic strains(40×)

3　結論

從不同地區采集野生大豆根、莖、葉器官，分離獲得內生真菌，對大豆疫霉病進行拮抗篩選，篩選出拮抗菌11株，即Y4-S(Ⅰ)、Y5-r(Ⅱ)-1、Y6R-15-1、Y1-r-3和Y5R4、Y6S-26、Y5LB、Y5r-12、Y2-5(Ⅱ)、Y2-S、Y5R18-2-1，菌株間菌落生長型態差異較大，而菌株的顯微結構極為相似，可能屬于同一種屬。這些拮抗真菌具有遺傳多樣性，為大豆生產中病害的生物防治提供了新的菌種來源。

[1] 馬淑梅，邵紅濤，韓新華.黑龍江大豆栽培品種和新品系對疫霉病抗性評價及抗病基因分析[J].中國農學通報，2013，29(30)：191-196.

[2] 王偉威，魏崍，丁俊杰，等.大豆品種(系)對不同疫霉菌生理小種的抗性研究[J].大豆科學，2014，33(4)：559-562.

[3] 徐鵬飛，姜良宇，李文濱，等．黑龍江省大豆品種對大豆疫霉根腐病抗性評價及抗性基因推導[J]．中國油料作物學報，2011，33(5)：521-526．

[4] 王光華，周克琴，張秋英，等.拮抗細菌BRF-1對幾種植物病原真菌的抗生效果[J].中國生物防治，2003，19(2)：73-77.

[5] 張淑珍，徐鵬飛，靳立梅，等． 野生大豆對大豆疫霉根腐病抗感反應及聚類分析[J]．東北農業大學學報，2009，40(11)：1-6．

[6] 李麗艷，蔣繼志，郭文.致病疫霉拮抗細菌的篩選及抑菌作用研究[J].安徽農業科學，2011，39(24)：14671-14675.

[7] 高同國，李術娜，張冬冬，等.大豆根腐病生防細菌優勢菌株的篩選、鑒定及生防效果驗證[J].大豆科學，2015，34(4)：661-665.

[8] 謝晶.植物病原菌拮抗微生物的篩選、鑒定及拮抗機理研究[D].成都：四川大學，2004.

Identification and Screening of Endophytic Fungi againstPhytophthorasojae

LIU Yong-zheng, BIAN Shuang, SUN Li-jie, XIAO Jia-lei*et al

(College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang 150030)

[Objective] Screening of antagonistic phytophthora pathogenic fungal strains provide the basis for further research and development of biological agents. [Method] Forty strains of fungus were tested. The inhibitory effect of wild soybean fungi on the wild soybean was determined by the method of plate confrontation. [Result] Among the tested 40 strains colony morphology are quite different from each other. On the analysis of smoothness, there are thirty-six colonies whose surface is not smooth, while three colonies appear smooth and pale yellow; On the analysis of colony colors, the front side is mainly white, followed by yellow and pink while, and the back side is mainly purple, followed by black and green; On the analysis of colony growth pattern, most of the colonies appear white flocculent protrusions or wool like hyphae.The inhibitory rates of 11 strains of wild soybean endophytic fungus are 62%-81%, with one strain of Y4-S (I)more than 80%, two strains in 75%-80%, three strains in 70%-75%, and the remaining five strains are less than 70%.Inhibition rate in descending order is Y4-S(Ⅰ), Y5-r(Ⅱ)-1,Y6R-15-1,Y1-r-3,Y5R4, Y6S-26, Y5LB, Y5r-12, Y2-5(Ⅱ),Y2-S,Y5R18-2-1. [Conclusion] The strongest antagonistic effect of strains are Y4-S (Ⅰ), Y5-r(Ⅱ)-1 and Y6R-15-1.They have similar microscopic form as dendritic, and they have separated. After a preliminary judgment, they may be a genus of unity, but their specific species require further judgment.

Phytophthorasojae; Wild soybean; Endophytic fungi; Antagonistic strains

黑龍江省自然基金項目(C2015008)；黑龍江省哈爾濱市人才專項(2015RQQXJ019)；國家青年基金項目(31101171)；東北農業大學創新項目SPIT(201610224154)。

劉永政(1994- )，男，黑龍江牡丹江人，本科生，專業：生物工程。*通訊作者，副研究員，博士，從事作物遺傳育種及高產栽培生理研究。

2016-06-20

S 565.1

A

0517-6611(2016)22-166-03