Box-Behnken響應面法優化吲哚美辛固體脂質納米粒處方Δ

陳　凱，李　收，金　凱，趙　晶，郝吉福#

（1.泰山醫學院藥學院，山東泰安　271016；2.濟寧醫學院附屬醫院藥劑科，山東濟寧　272000；3.棗莊科技職業學院醫學技術系，山東棗莊　277500）

Box-Behnken響應面法優化吲哚美辛固體脂質納米粒處方Δ

陳凱1，2＊，李收3，金凱1，趙晶1，郝吉福1#

（1.泰山醫學院藥學院，山東泰安271016；2.濟寧醫學院附屬醫院藥劑科，山東濟寧272000；3.棗莊科技職業學院醫學技術系，山東棗莊277500）

目的：優化吲哚美辛固體脂質納米粒處方。方法：以吲哚美辛為模型藥物、山崳酸甘油酯為油相、泊洛沙姆188和聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯為乳化劑，以濁度、包封率、載藥量為指標，采用Box-Behnken響應面法優化處方中油相用量、乳化劑-油相比例、藥物-油相比例。采用掃描電鏡、差示掃描熱分析（DSC）表征固體脂質納米粒的理化性質。結果：最優處方的油相用量為0.91%，乳化劑-油相比例為1∶1，藥物-油相比例為1∶5；所制吲哚美辛固體脂質納米粒的濁度為1 025～1 030 NTU，包封率為98.94%～99.08%，載藥量為2.43%～2.46%，粒徑為181.5～182.3 nm，多分散性指數（PDI）為0.340～0.341（n=3）；DSC結果顯示吲哚美辛不是以結晶狀態存在于固體脂質納米粒中。結論：成功篩選出最優處方，制得吲哚美辛固體脂質納米粒。

吲哚美辛；固體脂質納米粒；Box-Behnken響應面法；優化處方

吲哚美辛（Indomethacin，IDM）為非甾體抗炎藥，通過抑制前列腺素的合成而發揮解熱、鎮痛、消炎作用，臨床上用于治療類風濕性關節炎及電光眼、角膜炎、鞏膜炎等多種眼部炎癥［1-2］。近年來，微粒載體在黏膜遞藥系統中發展迅速，固體脂質納米粒（Solid lipid nanoparticles，SLN）是以脂質材料包裹或鑲嵌脂溶性藥物形成的粒徑為10～1 000 nm的固態膠粒。納米級粒徑賦予SLN較好的黏膜附著性與滲透性，使其易于通過融合或穿透機制進入黏膜而具有獨特優勢［3-4］。

Box-Behnken設計是普遍采用的一種優化方案［5-7］。本試驗以IDM為模型藥物，擬通過制備成SLN以改善其溶解度低的缺點，利用納米顆粒增加黏膜滲透性與穿透性等作用以提高IDM在治療眼部疾病中的應用，并采用Box-Behnken響應面法通過數學模型回歸方程優化IDM-SLN處方。

1　材料

1.1儀器

JY92-Ⅱ探頭超聲波細胞粉碎儀（寧波新芝科技股份有限公司）；超速冷凍離心機（美國Sigma公司）；WZS-185濁度計（上海雷磁儀器廠）。

1.2藥品與試劑

IDM對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100258-200904，純度：99.4%）；IDM原料藥（鄭州德寶精細化工有限公司，批號：20131218，純度：99.3%）；山崳酸甘油酯（Compritol?888 ATO，法國Gattefossé公司）；聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯（HS15）和泊洛沙姆188（北京鳳禮精求商貿有限公司）；其余試劑均為分析純。

2　方法與結果

2.1IDM-SLN的制備

采用熔融乳化超聲法制備IDM-SLN。將山崳酸甘油酯、IDM原料藥與適量無水乙醇水浴加熱至85℃融化作為油相。將泊洛沙姆188和HS15溶于蒸餾水中，水浴加熱至85℃左右形成水相。在攪拌下將水相加入熔融的油相中形成初乳，超聲（功率：600 W）10 min，制得淡藍色透明膠體溶液，0℃冰浴，1 000 r/min攪拌至油相脂質材料充分冷卻，即得IDM-SLN膠體溶液［8］。

2.2包封率和載藥量的測定

2.2.1IDM的含量測定及方法學考察采用紫外分光光度計測定IDM-SLN中IDM的含量。精密稱取IDM對照品適量，用無水乙醇制備成系列質量濃度的標準溶液，于200～400 nm波長范圍內進行掃描。結果發現，IDM在319 nm波長處有最大吸收。以IDM的質量濃度（c）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為A=7.234 7c-0.002 4（r=0.999 6），表明IDM質量濃度在0.025～4μg/ml范圍內線性關系良好。按相關方法考察0.025、0.25、2.5 μg/ml的IDM溶液的日內RSD分別為3.12%、1.87%、2.64%（n=5），日間RSD分別為3.78%、2.79%、3.17%（n=5），回收率分別為102.32%、99.25%、99.76%（RSD=1.63%），均符合方法學考察要求。

2.2.2包封率的測定采用乙醇溶解破壞和鹽析沉淀的方法測定IDM-SLN的包封率。精密量取1.0 ml IDM-SLN膠體溶液于10 ml量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，400 W功率下超聲10 min，1 800×g離心10 min，取上清液在319 nm波長處測定吸光度（A），由標準曲線計算上清液中IDM的總含量（M總量）；另取1.0 ml IDM-SLN膠體溶液加飽和硫酸銨鹽析，1 800×g離心10 min，取下層溶液測定吸光度（A）。由標準曲線計算游離IDM的含量（M游離），計算包封率=（M總量-M游離）/M總量×100%。

2.2.3載藥量的測定［9］采用冷凍干燥法測定IDM-SLN的載藥量。同“2.2.2”項下方法測定M總量和M游離。另精密量取IDMSLN膠體溶液1.0 ml，經冷凍干燥后測定凍干粉末中IDM的含量（M凍干），計算載藥量=（M總量-M游離）/（M凍干-M游離）×100%。

2.3濁度的測定

精密量取IDM-SLN膠體溶液5.0 ml，置于50 ml量瓶中，加雙蒸水稀釋至刻度，通過WZS-185濁度計測定濁度。

2.4處方優化

2.4.1Box-Behnken設計試驗根據預試驗結果，選擇顯著影響IDM-SLN處方的3個因素，即油相（山崳酸甘油酯）的用量［X1，%（m/m）］、乳化劑（泊洛沙姆188-HS15）-油相的比例（X2）、藥物-油相的比例（X3），每個因素的高、中、低3個水平分別以1、0、-1計，以濁度（Y1）、包封率（Y2）和載藥量（Y3）為響應值，采用Box-Behnken設計試驗建立數學模型優化處方，并用Design Expert軟件對試驗數據進行擬合分析［10］。因素與水平見表1，Box-Behnken試驗設計與響應值結果見表2。

表2　Box-Behnken試驗設計與響應值結果（n=3）Tab 2　Design and response values of Box-Behnken test（n= 3）

2.4.2數據處理利用Box-Behnken試驗軟件對各指標數據進行回歸分析，將數據擬合為二項式方程模型。結果Y1= 926.09+390.88X1+75.12X2-103.62X3+159.37X1X2-200.88X1X3-120.12X2X3-235.38X1X2X3，經F檢驗顯示方程具有顯著性（P=0.039 8），表明該回歸模型的擬合情況良好，能準確預測實際濁度；Y2=0.95+0.022X1-7.051×10-4X2+0.02X3-5.09×10-3X1X2-6.682×10-3X1X3+2.452×10-3X2X3+4.138×10-3X1X2X3，經F檢驗顯示方程無顯著性（P=0.406），說明該回歸模型的擬合情況不佳，不能準確預測實際包封率；Y3=0.018+ 1.767×10-4X1-2.072×10-3X2+6.214×10-3X3-4.875×10-4X1X2+ 1.16×10-3X1X3-2.23×10-4X2X3-3.891×10-5X1X2X3，經F檢驗顯示方程具有顯著性（P=0.031 4），表明該回歸模型的擬合情況良好，能準確預測實際載藥量。

2.4.3響應面法優化根據制劑設計需要，目標參數要求獲得Y1較小而Y2、Y3較大的處方。應用Design Expert設計軟件繪制因素對響應值影響的三維圖，結果見圖1。

由圖1中可知，油相的增加會使濁度明顯增大，而增大乳化劑的量會使濁度降低；當乳化劑-油相的比例增加時，包封率呈增加趨勢；乳化劑和藥物含量對載藥量影響顯著。在影響載藥量的各因素中，不同因素作用不盡相同：隨乳化劑的增加，載藥量呈降低趨勢；當藥物含量增加時，載藥量呈增加趨勢；但當乳化劑量固定時，隨油相增加載藥量呈略減小趨勢［11-12］。用Design Expert設計軟件對目標限定條件進行優化，將代碼數值轉化成優化的實際數值，優化后的處方為：油相（山崳酸甘油酯）用量為0.91%、乳化劑（泊洛沙姆188-HS15）-油相的比例為1∶1、藥物與油相的比例為1∶5。

2.5驗證試驗及形態觀察

按“2.4”項下優化后的處方制備3批IDM-SLN，測定濁度、包封率、載藥量、粒徑大小及多分散指數（Polydispersity index，PDI），并用電鏡觀察形態。驗證試驗結果見表3，粒徑分布見圖2，掃描電鏡圖見圖3。

2.6表征

將IDM原料藥、山崳酸甘油酯、IDM-SLN以及物理混合物進行差示掃描量熱法分析，升溫速度為10℃/min，升溫至230℃，氮氣保護。記錄差示掃描量熱曲線，結果見圖4。

由圖4可知，IDM的熔點為160.68℃，而IDM-SLN中并未出現IDM的吸熱峰，表明IDM在IDM-SLN中可能不是以結晶形態存在；物理混合物中表現出典型的山崳酸甘油酯的吸熱峰，但并未表現出顯著的IDM的熔融峰，這可能與差示掃描量熱測試環節溫度持續升高的過程中IDM與熔融的脂質載體形成低共融混合物有關。

3　討論

目前在藥劑學處方優化過程中，可以采用多種方法對處方進行設計，常用的有正交試驗設計和均勻試驗設計等方法，這兩種方法具有試驗次數少、使用普遍等優點，但所選擇的變量為一個點，不能對處方設計過程中形成的連續變量進行分析與預測處理。而Box-Behnken設計屬于響應面試驗設計的一種，可以在各設計的因素點與響應值之間連接成曲面，預測與分析在某個曲面過程中所選擇因素對響應值變化的影響，因而可以更直觀、更形象地分析因素與目標響應值之間的關系；同時還可以在因素與響應值之間建立數學模型，通過對數學模型的擬合進行分析，從而更準確地獲得最優工藝條件；其局限性在于試驗次數較多［13］。

圖1　因素與響應值關系的三維圖Ⅰ.濁度；Ⅱ.包封率；Ⅲ.載藥量Fig 1　Three-dimensional response surface plot of factors to response valueⅠ.turbidity；Ⅱ.entrapment efficiency；Ⅲ.drug loading amount

表3　驗證試驗結果（n=3）Tab 3　Results of validation test（n=3）

圖2　IDM-SLN的粒徑分布Fig 2　Particle size distribution of indomethacin-loading SLNs

圖3　IDM-SLN的掃描電鏡圖Fig 3　SEM photography of indomethacin-loading SLNs

圖4　4種樣品的差示掃描量熱圖Fig 4　DSC of 4kinds of sample

濁度是液體中懸浮物質對光線透過時所形成的阻礙程度，通過對濁度的測定可以間接反映粒徑大小。

由于SLN屬于高分散體系，乳化劑的增加能降低兩相之間表面張力，提高系統的穩定性，這與采用熔融乳化分散法形成SLN的機制有關。當脂質材料在加熱至其熔點后，形成液態的脂質載體，能夠溶解脂溶性藥物，故當脂質材料增加時能夠包載或鑲嵌更多的藥物，導致其包封率增加。在乳化劑對包封率的影響過程中，由于隨著乳化劑含量的增加系統穩定性增強，而使包載的藥量增大；但對載藥量而言，隨乳化劑濃度的增加，在體系中能形成膠團而促進藥物的溶解，因而使載藥量降低［14-15］。

本文應用Box-Behnken設計對IDM-SLN處方進行優化，并通過對數學模型的分析處理得出因素與響應值之間的相互關系，使其能夠方便、快捷、準確地獲得最優工藝條件，為IDMSLN的進一步研究奠定基礎。

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（編輯：鄒麗娟）

Formulation Optimization of Indomethacin-loading Solid Lipid Nanoparticles by Box-Behnken Response Surface Methodology

CHEN Kai1，2，LI Shou3，JIN Kai1，ZHAO Jing1，HAO Jifu1
（1.College of Pharmacy，Taishan Medical University，Shandong Tai'an 271016，China；2.Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Jining Medical University，Shandong Jining 272000，China；3.Dept.of Medical Technology，Zaozhuang Vocational College of Science and Technology，Shandong Zaozhuang 277500，China）

OBJECTIVE：To optimize the formulation of indomethacin-loading solid lipid nanoparticle（SLN）.METHODS：Using indomethacin as model drug，glyceryl behenate as oil phase，poloxamer 188 and polyethylene glycol-12-hydroxystearic acid as emulsifier，with turbidity，entrapment efficiency and drug loading amount as index，Box-Behnken response surface methodology was used to optimize the amount of oil phase，emulsifier-oil phase ratio，drug-oil phase ratio.The physicochemical properties of SLNs were characterized by SEM and DSC.RESULTS：The optimal formulation was as follows as oil phase of 0.91%，emulsifieroil ratio of 1∶1，drug-oil phase ratio of 1∶5.The turbidity，entrapment efficiency and drug loading amount of prepared nanoparticle were 1 025-1 030 NTU，98.94%-99.08%，2.43%-2.46%，respectively；particle size and polydispersity index（PDI）were 181.5-182.3 nm and 0.340-0.341（n=3）.The results of DSC showed that indomethacin was not present in crystalline state dispersed into SLNs.CONCLUSIONS：The optimal formulation is screened successfully，and indomethacin-loaded SLNs have been prepared.

Indomethacin；Solid lipid nanoparticle；Box-Behnken response surface methodology；Formulation optimization

R943

A

1001-0408（2016）22-3118-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.28

2013年地方高校國家級大學生創新創業訓練計劃項目（No.201310439013）

＊學士。研究方向：臨床藥學。電話：0538-6229751

副教授，碩士。研究方向：藥劑學、藥物新劑型研究與開發。E-mail：haojifu@163.com

2016-02-01

2016-05-26）