HPGPC法測定羧基麥芽糖鐵重均分子質量和分子質量分布Δ

李薔薇，李　強，鄭　筠，周　亮

（藥食同源植物資源開發四川省高校重點實驗室/四川抗菌素工業研究所/成都大學，成都　610052）

HPGPC法測定羧基麥芽糖鐵重均分子質量和分子質量分布Δ

李薔薇＊，李強#，鄭筠，周亮

（藥食同源植物資源開發四川省高校重點實驗室/四川抗菌素工業研究所/成都大學，成都610052）

目的：建立測定羧基麥芽糖鐵重均分子質量（Mw）和分子質量分布（D）的方法。方法：采用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）檢測3批羧基麥芽糖鐵注射液（進口）和羧基麥芽糖鐵原料（自制）的Mw和D。色譜柱為TSK G4000 PWXL，流動相為0.1%疊氮化鈉溶液，流速為0.5 ml/min，檢測器為示差折光檢測器，柱溫為35℃，進樣量為20μl。采用GPC軟件計算結果。結果：精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均小于3.0%（n=6）；進口樣品中Mw為157 667，D為1.30；自制品的Mw為162 000，D為1.42。結論：該方法精密度、穩定性、重復性、耐用性均較好，且操作簡便，可用于羧基麥芽糖鐵Mw和D的檢測。

高效凝膠滲透色譜法；羧基麥芽糖鐵；重均分子質量；分子質量分布

羧基麥芽糖鐵是一種治療缺鐵性貧血的新型補鐵劑，是羧基麥芽糖與氫氧化鐵的絡合物，化學名為多核鐵氫氧化物4 （R）-［聚（1→4）-O-α-D-吡喃葡萄糖基］-氧基-2（R），3（S），5（R），6-四羥己酸復合物，分子式為［FeOX（OH）Y（H2O）Z］n｛［（C6H1005）m（C6H1207）］l｝k，其中n≈103，m≈8，l≈11，k≈4，分子質量約16萬，CAS號9007-72-1，一般采用重均分子質量（Mw）和分子質量分布（D）來對本品的分子質量進行質量控制。本課題組參考2015年版《中國藥典》（二部）［1］的右旋糖酐鐵原料標準、2009版《英國藥典》［2］右旋糖酐鐵注射液標準的分子質量和D檢測項，建立測定羧基麥芽糖鐵Mw和D的高效凝膠滲透色譜（HPGPC）法（也稱分子排阻色譜法），并對其進行方法學考察，以期為該品種的質量控制提供參考。

1　材料

1.1儀器

LC-10AT型高效液相色譜儀，包括LC-10AT型輸液泵、RID-10A示差折光檢測器（日本島津公司）；GPC色譜工作站和GPC計算軟件（北京龍智達科技開發有限公司）；AE163型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2藥品與試劑

右旋糖酐對照品（分子質量D0-即葡萄糖，中國食品藥品檢定研究院，批號：140637-201203）；系列葡聚糖對照品（Mw分別為23 800、48 600、147 600、273 000，美國Sigma-Aldrich公司）；羧基麥芽糖鐵注射液（Vifor Pharma Deutschland GmbH公司，批號：20150523，規格：100 mg/2 ml）；羧基麥芽糖鐵原料（四川抗菌素工業研究所實驗室自制品，批號：20150907，規格：100 mg/2 ml）；疊氮化鈉（上海恒遠生物科技有限公司，分析純）；水為超純水（四川抗菌素工業研究所實驗室自制）。

2　方法與結果

2.1溶液的制備

2.1.1對照品A溶液分別精密稱取系列葡聚糖對照品，加流動相溶解并稀釋制成10 mg/ml的溶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.2對照品B溶液精密稱取右旋糖酐對照品（D0），加流動相溶解并稀釋制成10 mg/ml的溶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3羧基麥芽糖鐵注射液溶液精密量取羧基麥芽糖鐵注射液1 ml，置于50 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.4羧基麥芽糖鐵原料溶液取羧基麥芽糖鐵原料，加流動相溶解，稀釋制成含鐵（Fe）1 mg/ml的溶液，搖勻，即得。

2.2色譜條件與系統適用性試驗

以TSK G4000 PWXL（300 mm×7.8 mm，10μm）為色譜柱，以0.1%疊氮化鈉溶液為流動相，柱溫為35℃，流速為0.5 ml/min，采用示差折光檢測器；理論板數按葡萄糖峰（即右旋糖酐D0對照品峰）計算，應不小于5 000，標樣為已知分子質量的系列葡聚糖對照品。

2.3標準曲線的制作

取對照品A溶液，按2015年版《中國藥典》（二部）［1］附錄ⅤH分子排阻色譜法測定，取20 μl注入液相色譜儀中，記錄色譜圖及保留時間，結合已知的葡聚糖對照品的Mw，以lgMi對tRi作圖，結果見圖1。回歸方程為lgMi=0.33tRi-10.48，相關系數r 為0.999 8。

圖1　標準曲線Fig 1　Standard curves

2.4專屬性試驗

取“2.1.4”項下的羧基麥芽糖鐵原料溶液和空白溶劑（流動相），分別按“2.2”項下色譜條件進樣20 μl檢測，空白溶劑譜圖在羧基麥芽糖鐵色譜峰保留時間處無色譜峰出現，說明溶劑無干擾。

2.5精密度試驗

取對照品A溶液中的葡聚糖對照品Mw值為147 600的對照品溶液，進樣質量濃度為10 mg/ml，按“2.2”項下的方法連續測定6次，記錄色譜圖。Mw值測定結果分別為147 000、148 000、147 200、146 500、146 800、147 000，平均值為147 083，RSD 為0.34%（n=6），說明本測定方法精密度好。

2.6穩定性考察

取羧基麥芽糖鐵原料，加流動相制成質量濃度為10 mg/ ml的溶液，按“2.2”項下的方法測定溶液在24 h內的穩定性，記錄色譜圖。結果，0、2、4、8、12、16、20、24 h Mw分別為162 000、160 000、160 000、161 000、162 000、161 000、160 000、160 000，RSD為0.55%（n=8），說明樣品溶液在24 h內測定是穩定的。

2.7重復性試驗

取羧基麥芽糖鐵原料6份，分別加流動相制成質量濃度為10 mg/ml的溶液，按“2.2”項下的方法測定，記錄色譜圖。Mw值測定結果分別為161 000、162 000、161 000、160 000、160 000、161 000，RSD為0.47%（n=6），說明測定方法重復性好。

2.8耐用性考察

取“2.1.2”項下系統適用性溶液，采用安捷倫1200高效液相色譜儀、安捷倫示差折光檢測器、賽分科技SRT?SEC-100凝膠色譜柱（300 mm×7.8 mm，10 μm），按“2.2”項下色譜條件進樣20 μl測定，樣品Mw與D的測定結果和TSK G4000 PWXL色譜柱相比無明顯差別，證明該方法耐用性良好。

2.9樣品測定

按2015年版《中國藥典》（二部）［1］附錄ⅤH分子排阻色譜法測定，Mw應在115 000～175 000之間，D應小于2.0。取本品適量，加流動相稀釋成每1 ml約含10 mg的溶液，搖勻，濾過，作為供試品溶液。取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。根據標準曲線，采用GPC專用軟件計算出供試品的Mw與D。取羧基麥芽糖鐵注射液3份及羧基麥芽糖鐵原料3份，按“2.2”項下方法測定，結果見表1。

表1　羧基麥芽糖鐵重均分子質量及分子質量分布檢測結果Tab 1　Mwand D of ferric carboxymaltose

表1結果顯示，自制品的Mw、D與進口樣品基本一致。

3　討論

3.1檢測器的選擇

示差折光檢測器是一種通用型檢測器，具有廣泛的適用范圍；同時該檢測器對糖類檢測靈敏度較高、穩定性好、操作方便。另查閱2015年版《中國藥典》（二部）［1］，絕大多數天然高分子藥物或者高分子聚合物藥物的檢測均使用示差折光檢測器，故選擇其作為本研究的檢測器。

3.2流動相比例的選擇

凝膠色譜的分離原理是分子篩原理，根據分子的大小不同進行分離。羧基麥芽糖鐵注射液pH值介于5.0～6.5之間，確定具有一定離子強度的0.1%疊氮化鈉溶液為流動相，既可以減少樣品在柱上的吸附，也可防止在色譜分離過程中樣品分子之間相互締合，以保持其溶液中正常的分子形態。

3.3分子排阻色譜法

凝膠色譜技術又稱分子排阻色譜法，是20世紀60年代初發展起來的一種快速、簡單的分離分析技術，主要用于高聚物的相對分子質量分級分析以及相對分子質量分布測試［4］。分子排阻色譜法是根據待測組分的分子大小進行分離的一種液相色譜技術。分子排阻色譜法的分離原理為凝膠色譜柱的分子篩機制。色譜柱多以親水硅膠、凝膠或經修飾凝膠如葡聚糖凝膠（Sephadex）和聚丙烯酰胺凝膠（Sepharose）等為填充劑，這些填充劑表面分布著不同尺寸的孔徑，藥物分子進入色譜柱后，其中的不同組分按其分子大小進入相應的孔徑內，大于所有孔徑的分子不能進入填充劑顆粒內部，在色譜過程中不被保留，最早被流動相洗脫至柱外，表現為保留時間較短；小于所有孔徑的分子能自由進入填充劑表面的所有孔徑，在色譜柱中滯留時間較長，表現為保留時間較長；其余分子則按分子大小依次被洗脫。

3.4羧基麥芽糖鐵Mw與D的控制

羧基麥芽糖鐵屬于高分子聚合物的范疇，所以Mw與D是該品種質量控制的重要指標，在一定程度上可以反映出國產樣品與進口上市品之間的質量差異。在靜脈補鐵劑第一代產品右旋糖酐鐵注射液的臨床使用過程中，過敏反應是主要的不良反應，主要為過敏性休克和過敏性皮炎，也有過敏反應引起死亡的報道［3］。章蘊毅等［5］報道，制劑1中右旋糖酐鐵峰位分子質量約為15萬，而制劑2的峰位分子質量約為42萬，兩者差別巨大。因此，可推測制劑1吸收快，在體內分布利用也快［5］。作為一種大分子多聚物的注射液，羧基麥芽糖鐵注射液與右旋糖酐鐵注射液一樣，其分子質量的大小與產品的致敏性以及體內吸收和分布有直接關系。一般不建議樣品的分子質量過大，因為會增加其在體內安全性方面的風險。

由于2015年版《中國藥典》（二部）［1］的右旋糖酐原料和注射液標準中只規定測定右旋糖酐的分子質量與D，而2009版《英國藥典》［2］未對分子質量與D進行規定。《中國藥典》的方法為將右旋糖酐鐵水解，測定右旋糖酐的分子質量。右旋糖酐本身為葡萄糖聚合物，水解是否對其結構產生影響、水解前后的分子質量是否一致、不同的絡合工藝在此水解條件下是否完全，有待研究。進口藥品標準考察的是整個右旋糖酐鐵絡合物的分子質量，從對人體組織吸收的角度看，更合理些［6］。另外，由于各個生產企業工藝控制的差異，僅僅通過控制起始原料的分子質量，應不能完全控制最終產品右旋糖酐鐵的分子質量的范圍［7-8］。同理，羧基麥芽糖鐵作為右旋糖酐鐵的升級換代產品，其Mw與D仍然是其質量控制的重要指標，故建議在廠家生產羧基麥芽糖鐵原料及注射液時應由廠家自行增加Mw與D項的檢測，以更好地控制產品質量，降低其安全性風險。

4　結語

目前供臨床使用的靜脈補鐵劑有以下7種：高分子右旋糖酐鐵、低分子右旋糖酐鐵、葡萄糖酸鈉鐵、蔗糖鐵、羧基麥芽糖鐵、Ferumoxytol、Iron isomal-toside 1000。所有的靜脈補鐵劑均為膠體溶液，化學機構大體相近，均由鐵-碳水化合物納米微粒組成，微粒中心為氫氧化鐵核心，不同的糖類配體包裹形成外殼，糖類配體外殼可以穩定鐵核心，控制鐵的釋放，維持微粒處于懸浮的膠體狀態。核心大小的不同及糖類配體構成、密度上的差異決定了不同鐵劑的藥理生物學的不盡相同［9］。所以，Mw與D將成為該類藥物最重要的質量控制指標之一。黃一新等［10］報道，靜脈鐵劑在治療血液透析貧血患者鐵缺乏時安全有效，并優于口服鐵劑［10］；徐維國等［11］報道，靜脈注射右旋糖酐鐵可有效糾正消化性潰瘍出血致缺鐵性貧血患者的鐵缺乏、提高鐵利用率，且不良反應發生率低、患者依從性好［11］。相信隨著新型靜脈補鐵劑不斷進入國內外臨床，其今后會有更加廣闊的應用前景［8］。

綜上所述，該方法精密度、穩定性、重復性、專屬性和耐用性均較好，且操作簡便，可用于羧基麥芽糖鐵Mw和D的檢測。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部［S］.2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：171-172.

［2］ British Pharmacopoeia Commission.British Pharmacopoeia：VolumeⅡ：2000［M］.London：the Stationery Office，2009：2 040-2 041.

［3］程春雷，范治云，祝清芬，等.右旋糖酐鐵注射液不良反應文獻分析［J］.中國藥業，2013，22（8）：79.

［4］楊立偉，肖樹雄，謝海燕，等.凝膠色譜法測定參芪扶正注射液中的高分子物質［J］.中國藥房，2011，22（15）：1 400.

［5］章蘊毅，李佩芬，杜一鳴，等.2種右旋糖酐鐵給藥后的家兔體內血清鐵濃度及毒性比較［J］.中國新藥與臨床雜志，2005，24（6）：444.

［6］萬丹晶，陳妙芬，陳鋼.右旋糖酐鐵注射液峰位相對分子質量和重均相對分子質量的HPGPC測定［J］.藥物分析雜志，2007，27（5）：708.

［7］翟晨淏，陳東英，郜盡.右旋糖酐鐵注射液中右旋糖酐鐵峰位相對分子質量的測定［J］.中國新藥與臨床雜志，2005，24（6）：438.

［8］范慧紅，劉金秀，徐康森.高效凝膠滲透色譜法在右旋糖酐鐵質控中的應用［J］.藥物分析雜志，2000，20（4）：254.

［9］毛凱，馬怡璇，潘紅春，等.新型靜脈補鐵劑的研究進展［J］.中國新藥雜志，2015，24（6）：659.

［10］黃一新，張政，黃振飛，等.靜脈注射右旋糖酐鐵優于口服琥珀酸亞鐵治療血液透析鐵缺乏貧血［J］.中國新藥與臨床雜志，2003，22（7）：420.

［11］徐維國，崔蓉，冷小輝.靜脈用右旋糖酐鐵注射液治療消化性潰瘍出血患者缺鐵性貧血的臨床研究［J］.四川省衛生管理干部學院學報，2007，26（4）：241.

（編輯：余慶華）

Determination of Weight Average Molecular Weight and Molecular Weight Distribution of Ferric Carboxymaltose by HPGPC

LI Qiangwei，LI Qiang，ZHENG Yun，ZHOU Liang
（Key Laboratory of Medicinal and Edible Plants Resources Development of Sichuan Education Department/Sichuan Industrial Institute of Antibiotics/Chengdu University，Chengdu 610052，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of weight average molecular weight（Mw）and molecular weight distribution（D）of ferric carboxymaltose.METHODS：HPGPC method was adopted to detect the Mwand D of 3 batches of Ferric carboxymaltose injection（imported）and its raw material（self-made）.The determination was performed on TSK G4000 PWXL column with 0.1%sodium azide solution with the flow rate of 0.5 ml/min.The detector was refractive index detector；the column temperature was set at 35℃，and sample size was 20μl.The results were calculated with GPC software.RESULTS：RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 3.0%（n=6）；Mwand D of 3 imported samples were 157 667 and 1.30；those of self-made samples were 162 000 and 1.42.CONCLUSIONS：The method has high precision，good stability，repeatability and durability.It can be used for the determination of Mwand D of ferric carboxymaltose.

HPGPC method；Ferric carboxymaltose；Weight average molecular weight；Molecular weight distribution

R917

A

1001-0408（2016）22-3066-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.13

藥食同源植物資源開發四川省高校重點實驗室開放基金項目（No.10Y201504）

＊助理研究員。研究方向：藥物制劑、藥物分析。電話：028-84216070。E-mail：liqiangwei@cdu.edu.cn

助理研究員。研究方向：藥物合成。電話：028-84216070。E-mail：liqiang@cdu.edu.cn

2015-12-17

2016-05-06）