探討長期酒精暴露對視網膜的損傷

楊海霞　張洪亮　吳　睿　趙國強

1)河南新密市鄭州新華醫院　新密　452370　2)河南省省直第二醫院　鄭州 450003　3)鄭州大學第二附屬醫院　鄭州　450014　4)鄭州大學基礎醫學院　鄭州　450001

?

探討長期酒精暴露對視網膜的損傷

楊海霞1)張洪亮2)吳睿3)趙國強4)

1)河南新密市鄭州新華醫院新密4523702)河南省省直第二醫院鄭州 4500033)鄭州大學第二附屬醫院鄭州4500144)鄭州大學基礎醫學院鄭州450001

目的探討患者長期酒精暴露對視網膜的損傷。方法選取野生型(wild type，WT)小鼠27只，酒精暴露建立動物模型，利用熒光抗體染色法觀察視網膜膠質細胞的變化。結果長期酒精暴露后，小鼠視網膜膠質細胞出現損傷，如Müller細胞GS染色減弱、星形膠質細胞數量減少，并且呈劑量依賴性(P< 0.05)。結論長期酒精暴露可通過改變視網膜的膠質細胞Müller細胞和星形膠質細胞的數量和形態對視網膜造成損傷，且呈劑量依賴性。

酒精暴露；視網膜；膠質細胞；熒光抗體染色法

哺乳動物的中樞神經系統中，視網膜內含有豐富的谷氨酸，在生理情況下，它傳遞神經信號，是一種神經遞質。正常情況下，視網膜細胞間質中的谷氨酸濃度較高，通過神經膠質細胞膜上的谷氨酸轉運體轉進入細胞內，經由谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)轉化為谷氨酰胺，而使其毒性作用大大減弱或消失，從而保護神經節細胞免受谷氨酸的毒性損害作用。一些病理情況下，如眼外傷、高眼壓、糖尿病等，視網膜內谷氨酸濃度異常升高，過度刺激神經節細胞表面的谷氨酸受體，從而進一步通過胞內信號傳導通路，導致細胞膜內的鈣離子通道開放，細胞內的鈣離子升高超載，引起興奮性的毒性作用，從而導致視網膜神經節細胞死亡及視網膜功能障礙。

在視網膜內，神經膠質細胞Müller細胞的作用非常重要，它維持視網膜內谷氨酸的平衡，進一步保護視網膜的神經節細胞，免受谷氨酸的興奮性毒性作用；視網膜內的星形膠質細胞參與血-視網膜屏障的形成，是神經元同血管細胞之間的橋梁，也發揮著對神經元細胞活動的調節作用，另外還對一些大分子物質在膠質細胞間的擴散進行調節，且具有神經元營養保護作用。長期酒精暴露是否對視網膜Müller細胞和星形膠質細胞產生損傷，目前無明確報道。本研究探討酒精暴露對視網膜的損傷情況，以利于臨床有關疾患的診治預防。

1　材料與方法

1．1動物標本選取成年小鼠(其基因型為C57BL/6J)。小鼠分區分籠飼養在標準化的條件下，小鼠可自由進食、飲水，晝夜節律是自然狀態(小鼠和標準飼料均購自河南省實驗動物中心)。所有的小鼠需要排除全身和眼部疾病。小鼠的墊料定期更換、動物實驗室定期消毒。實驗模型建立后，制作小時視網膜標本，其具體步驟：(1)通過腹腔注射異戊巴比妥鈉(30 mg/kg)將小鼠麻醉；(2)經心灌流4%的多聚甲醛(pH 7.2)，從而固定標本；(3)取出完整的雙側眼球；(4)一只眼球再用4%多聚甲醛繼續浸泡固定0.5 h(4 ℃)后，去除角膜與晶狀體，解剖取出完整的視網膜，以視盤為中心，呈放射狀剪成四葉，4%的多聚甲醛固定1 d后，做成視網膜鋪片，4 ℃保存備用；另一只眼球4%的多聚甲醛浸泡固定2 d(4 ℃)，做成石蠟切片，4 ℃保存備用。

1．2主要儀器設備(1)熒光顯微鏡(Olympus，BX61，Japan)；(2)振蕩器(VG 3 S25，IKA，Germany)；(3)石蠟切片機(LR 59590型，USA)；(4)微量加樣槍(Eppendorf Germany)；(5)振蕩切片機(LR 59590型，USA)；(6)微量高速離心機(TG 16W型，長沙)。

1．3免疫組化試劑抗體稀釋液和多聚賴氨酸，均購置于福州邁新生物技術有限公司；載玻片、蓋玻片購置于鄭州玻璃儀器廠；磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、氫氧化鈉(NaOH)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、多聚甲醛、異戊巴比妥鈉、乙醇均購于開封開化公司；鼠抗GS多抗和兔抗GFAP單抗購于Abcam公司；Alexa 568驢抗兔IgG、Alexa568驢抗鼠IgG、Alexa488驢抗鼠IgG購于Invitrogen公司。

1．4實驗操作主要試劑的配制詳見各說明書。選取27只成年C57BL/6J小鼠，隨機分為3組，每組9只：(1)高劑量酒精組(high ethyl alcohol group，H-EtOH)，每天每只小鼠胃飼濃度25%的酒精，4.0 g/kg，連續胃飼3個月；(2)低劑量酒精組(low ethyl alcohol group，L-EtOH)，每天每只小鼠胃飼濃度25%的酒精，2.0 g/kg，連續胃飼3個月；(3)對照組(control group)，每天每只小鼠胃飼蒸餾水，4.0 g/kg，連續胃飼3個月。視網膜石蠟切片、整體鋪片、及免疫組化熒光染色等詳見實驗記錄。

1．5統計學分析數據用Means±SD表示，采用SPSS 17.0 統計學軟件單因素方差分析及隨后的LSD檢驗高劑量酒精組、低劑量酒精組和對照組。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2．1長期酒精暴露對小鼠視網膜星形膠質細胞的影響星型膠質細胞的足板是血-視網膜屏障的重要組成部分[1]。視網膜鋪片中，可觀察到星型膠質細胞的免疫染色顯示在視網膜表面，正常情況下，星形膠質細胞的染色強，胞體很小，分支較多，突起非常明顯。低劑量酒精組小鼠視網膜內的星形膠質細胞GFAP(膠質纖維酸性蛋白)染色有所減弱，高劑量酒精組小鼠視網膜內的星形膠質細胞GFAP染色顯著降低，同時，還伴膠質細胞肥大改變，胞體明顯增粗，突起與分支減少(圖1)。統計結果顯示：酒精暴露可劑量依賴性地使視網膜內的星形膠質細胞形態改變和數量減少(圖3，P<0.05)。

2．2長期酒精暴露對視網膜Müller細胞的影響視網膜中Müller細胞是一種特殊的神經膠質細胞，大致可分為胞體、內側突起和外側突起；胞體主要分布在內核層，胞體呈橢圓形或者多角形，核周胞質較少，胞體向內外兩側發出突起，占據從內界膜到外界膜整個視網膜厚度。低劑量酒精組小鼠視網膜Müller細胞GS染色減弱，高劑量酒精組小鼠視網膜Müller細胞GS染色明顯降低(圖2)。統計結果顯示，酒精暴露可劑量依賴性地使視網膜Müller細胞數量減少(圖4，P<0.05)。

圖1　長期酒精暴露對小鼠視網膜星形膠質細胞數量的影響(GFAP標記)

圖2　長期酒精暴露對小鼠視網膜Müller細胞數量的影響(GS標記)

圖3　長期酒精暴露對小鼠視網膜星形膠質細胞數量的影響　圖4　長期酒精暴露對小鼠視網膜Müller細胞數量的影響

3　討論

研究表明，脊椎動物的視網膜，主要是有三種不同的神經膠質細胞：Müller細胞、星形膠質細胞和小膠質細胞[2]。長期酒精暴露后，小鼠視網膜的膠質細胞，出現損傷，如Müller細胞和星形膠質細胞均減少，并伴有肥大改變，表現為胞體增粗與突起分支減少。

Müller細胞的分布，是從外界膜到內界膜的整個視網膜厚度，并其突起包繞與聯系視網膜上之各類神經細胞，及與視網膜神經細胞的交互作用發生多種功能，參與形成血視網膜屏障。近年研究表明，Müller細胞是可以用來修復一些受損傷的神經元[3-4]。目前Müller細胞的具體功能尚未形成統一的定論，但傳統研究認為：視網膜中Müller細胞，一般主要起支持和營養作用，作為神經元的起支架作用，保持視網膜的完整性及儲存大量糖原，部分為神經元提供能量等。近期不斷深入研究發現，Müller細胞不僅簡單的起支持營養作用，且具有更為復雜的生理功能與病理意義[5]。近來，有大量研究發現，如果Müller細胞外面的谷氨酸濃度升高，則會造成神經元的損傷與死亡；并且視網膜中，Müller細胞是能夠表達高親和力的谷氨酸轉運體，然后將細胞外高濃度的谷氨酸進一步轉運至細胞內，通過谷氨酰胺合成酶，將其轉化為谷氨酰胺，消除其對神經元細胞的毒性作用[6]，進而可以減輕對視網膜的毒性作用。另外，Müller細胞也能夠通過合成谷胱甘肽，從而消除自由基等對神經元的損傷作用[7]。

視網膜內的星形膠質細胞，則是可以參與血-視網膜屏障的形成，且能對其功能進行調控。星形膠質細胞也是神經元細胞同血管壁細胞等活動之間的橋梁，主要作用也是通過高效率的表達谷氨酸轉運體，進一步參與谷氨酸的代謝，再通過產生的鈣調節，發揮其對神經元細胞的活動的調節作用。另外星形膠質細胞還對一些大分子物質，在膠質細胞間的擴散進行調節。星形膠質細胞還具有神經元營養保護作用。因此認為，如視網膜內的星形膠質細胞發生損傷，那么視網膜內的血管與神經元細胞，則都會產生很大影響。GFAP(glial fibrillary acidic protein)是一種中間絲蛋白，正常情況下，在視網膜中，只有星形膠質細胞才可以表達，但是目前國內外，GFAP在視網膜中的功能，均無明確定論。通過對敲除GFAP基因的小鼠研究發現，在這些小鼠的大腦海馬處，它們的突觸傳遞發生了明顯改變，且血-腦屏障也發生了一定程度的損害[8]。有研究發現，一些培養的大腦星形膠質細胞，其膠質纖維酸性蛋白(GFAP)，可以參與細胞內谷氨酰胺含量的調節[9]。這說明，GFAP不僅可誘導大動脈的內皮細胞分化，進而形成血-腦屏障，同時GFAP還參與了β淀粉蛋白的反應性調節[10-11]。因此，如果視網膜星形膠質細胞中GFAP的表達減少，則表明其代謝功能已經發生了改變，其主要表現是誘導內皮細胞表達的血-視網膜屏障特性功能降低。本研究實驗中發現，長期的酒精暴露后，能夠劑量依賴性地使視網膜星形膠質細胞的數量明顯減少，提示其對血-視網膜屏障造成了損傷。

綜上，本實驗表明，長期的酒精暴露能夠造成視網膜Müller細胞和膠質細胞的呈劑量依賴性損傷，提示長期飲酒人員可能對視網膜的累積損傷及其影響。

[1]Ogden TE．Nerve fiber layer of the Primate retina：thiekness and glial content[J]．Vision Res，1983，23(6)：581-587．

[2]Hicks D，Courtois Y．The growth and behavior of rat retinal Muller cells in vitro．An improved method for isolation and culture[J]．Exp Eye Res，1990，51(2)：119-129．

[3]Yurco P，Cameron DA．Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebra fish [J]．Vision Res，2005，45(8)：991-1 002．

[4]Fischera J，Reht A．Muller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina[J]．Nat Neurosci，2001，4(3)：247-252．

[5]李樹寧，王華．視網膜中的Muller細胞[J]．眼科研究，2005，1(23)：105-110．

[6]Barnett NL，Powd V．Antisense knock down of GLAST，a glial glutamate transporter，compromises retinalfunction[J]．Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41(2)：585-591．

[7]Schutte M，Werner P．Redistribution of glutathionein the ischemic rat retina[J]．Neurosci Lett，1998，246(1)：53-56．

[8]McCall MA，Gregg RG，Behringer RR，et al．Targeted delection in astrocyte intermediate filament(GFAP)alters neuronal Physiology[J]．Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(13)：6 361-6 366．

[9]PeKny M，Eliasson C，Siushansian R，et al．The impact of genetic removal of GFAP and/or vimentin on glutamine levels and transport of glucose and ascorbate in astrocytes[J]．Neurochem Res，1999，24(11)：1 357-1 362．

[10]Pekny M，Stanness KA，Eliasson C，et al．Impaired induction of lood-bbrain barrier properties in aortic endothelial cells by astrocytes from GFAP-deficient mice[J]．Glia，1998，22(4)：390-400．

[11]Xu K，Malouf AT，Messing A，et al．Glial fibrillary acidic protein is necessary for mature astrocytes to beta-amyloid[J]．Glial，1999，25(4)：390-403．

(收稿2015-09-12)

R-332

B

1673-5110(2016)18-0067-03